羅氏沼蝦中性別發(fā)育相關(guān)基因Sxl和Dmrt基因的分子特征和功能研究.pdf

1、羅氏沼蝦（Macrobrachiumrosenbergii）是一種重要的淡水經(jīng)濟蝦類，廣泛分布在熱帶及亞熱帶地區(qū)。該蝦生長快，個體大且食性雜，具有很高的經(jīng)濟價值。目前有關(guān)羅氏沼蝦的育種和養(yǎng)殖技術(shù)都有了長足的進步，但是對潛藏在雌雄個體的性別兩態(tài)性下的分子機制知之甚少。本研究以羅氏沼蝦為研究對象，從動物保守性別決定核心途徑中選取了兩種最為重要的關(guān)鍵基因Sxl和Dmrt，開展了結(jié)構(gòu)解析及其在沼蝦性別發(fā)育和生殖中重要作用的相關(guān)研究。
　　

2、 第一部分，羅氏沼蝦Sxl基因的分子結(jié)構(gòu)解析和功能分析。
　　 首先，通過簡并PCR的方法克隆得到了一個Sxl的片段，以這個片段為探針，篩選羅氏沼蝦的神經(jīng)節(jié)cDNA文庫并測序，通過比對分析得到了四個異構(gòu)體。基因全長分別為2054、1977、1897和1031bp，依次命名為MroSxl1、MroSxl2、MroSxl3和MroSxl4。Northernblotting和異構(gòu)體特異性的RT-PCR的結(jié)果都證明了這四個異構(gòu)體在羅氏

3、沼蝦中的確實存在。采用Southernblotting的方法研究Sxl在基因組的拷貝情況，結(jié)果表明MroSxl基因在羅氏沼蝦的基因組中只存在一個拷貝形式。
　　 其次，通過異構(gòu)體特異性RT-PCR和Westernblotting在雌雄個體中檢測四種異構(gòu)體是否存在著雌雄差異性，RT-PCR結(jié)果表明四種MroSxl異構(gòu)體在雌雄個體中同時存在，Westernblotting的結(jié)果也證明了在蛋白水平上MroSXL在雌雄蝦中都有表達，不存

4、在性別特異性表達的MroSXL。其中MroSXL3/4在雌蝦的神經(jīng)節(jié)、肝胰臟和卵巢中特異性的高量表達。進一步對雌雄蝦生殖腺的免疫組化證明:在雄蝦精巢中該蛋白主要在精原細胞中表達，在精子中沒有表達;在雌蝦卵巢的卵子發(fā)生早期SXL蛋白主要在細胞質(zhì)中表達，隨著卵母細胞進入到卵黃發(fā)生階段，蛋白主要集中在細胞核中。
　　 第二部分，羅氏沼蝦Dmrt基因的分子結(jié)構(gòu)解析和功能分析。
　　 首先，我們通過簡并PCR和RACE的克隆方法得

5、到了兩個Dmrt基因，一個基因全長2073bp，包含了一個1614bp的開放閱讀框，編碼形成一個537aa的蛋白;另一個基因全長906bp，包含了一個618bp的開放閱讀框，編碼形成一個205aa的蛋白，通過對氨基酸序列的分析證明都包含了Dmrt家族特有的DM結(jié)構(gòu)域——一個特殊的鋅指結(jié)構(gòu)。通過系統(tǒng)進化關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)這兩個基因分別屬于Dmrt11E和Dmrt99B分支，因此分別命名為MroDmrt11E和MroDmrt99B。
　　

6、 其次，采用半定量RT-PCR的方法研究這兩個基因在mRNA水平上的表達特征，結(jié)果表明羅氏沼蝦中兩個MroDmrt基因都表現(xiàn)出了明顯的性別特異性:MroDmrt11E主要在精巢中有高量表達，在兩性的神經(jīng)節(jié)中有一定程度的表達，在卵巢表達極低（少于精巢的1/10，P＜0.01）;而MroDmrt99B特異性的表達在精巢中且表達量較低。在胚胎發(fā)育過程中，兩個基因都呈現(xiàn)隨著胚胎發(fā)育的進行表達量隨之升高，相對的MroDmrt99B有一個滯后性。<