羅氏沼蝦中性別發(fā)育相關(guān)基因Sxl和Dmrt基因的分子特征和功能研究.pdf

1、羅氏沼蝦（Macrobrachiumrosenbergii）是一種重要的淡水經(jīng)濟(jì)蝦類，廣泛分布在熱帶及亞熱帶地區(qū)。該蝦生長快，個(gè)體大且食性雜，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前有關(guān)羅氏沼蝦的育種和養(yǎng)殖技術(shù)都有了長足的進(jìn)步，但是對(duì)潛藏在雌雄個(gè)體的性別兩態(tài)性下的分子機(jī)制知之甚少。本研究以羅氏沼蝦為研究對(duì)象，從動(dòng)物保守性別決定核心途徑中選取了兩種最為重要的關(guān)鍵基因Sxl和Dmrt，開展了結(jié)構(gòu)解析及其在沼蝦性別發(fā)育和生殖中重要作用的相關(guān)研究。
　　

2、 第一部分，羅氏沼蝦Sxl基因的分子結(jié)構(gòu)解析和功能分析。
　　 首先，通過簡并PCR的方法克隆得到了一個(gè)Sxl的片段，以這個(gè)片段為探針，篩選羅氏沼蝦的神經(jīng)節(jié)cDNA文庫并測序，通過比對(duì)分析得到了四個(gè)異構(gòu)體?；蛉L分別為2054、1977、1897和1031bp，依次命名為MroSxl1、MroSxl2、MroSxl3和MroSxl4。Northernblotting和異構(gòu)體特異性的RT-PCR的結(jié)果都證明了這四個(gè)異構(gòu)體在羅氏

3、沼蝦中的確實(shí)存在。采用Southernblotting的方法研究Sxl在基因組的拷貝情況，結(jié)果表明MroSxl基因在羅氏沼蝦的基因組中只存在一個(gè)拷貝形式。
　　 其次，通過異構(gòu)體特異性RT-PCR和Westernblotting在雌雄個(gè)體中檢測四種異構(gòu)體是否存在著雌雄差異性，RT-PCR結(jié)果表明四種MroSxl異構(gòu)體在雌雄個(gè)體中同時(shí)存在，Westernblotting的結(jié)果也證明了在蛋白水平上MroSXL在雌雄蝦中都有表達(dá)，不存

4、在性別特異性表達(dá)的MroSXL。其中MroSXL3/4在雌蝦的神經(jīng)節(jié)、肝胰臟和卵巢中特異性的高量表達(dá)。進(jìn)一步對(duì)雌雄蝦生殖腺的免疫組化證明:在雄蝦精巢中該蛋白主要在精原細(xì)胞中表達(dá)，在精子中沒有表達(dá);在雌蝦卵巢的卵子發(fā)生早期SXL蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，隨著卵母細(xì)胞進(jìn)入到卵黃發(fā)生階段，蛋白主要集中在細(xì)胞核中。
　　 第二部分，羅氏沼蝦Dmrt基因的分子結(jié)構(gòu)解析和功能分析。
　　 首先，我們通過簡并PCR和RACE的克隆方法得

5、到了兩個(gè)Dmrt基因，一個(gè)基因全長2073bp，包含了一個(gè)1614bp的開放閱讀框，編碼形成一個(gè)537aa的蛋白;另一個(gè)基因全長906bp，包含了一個(gè)618bp的開放閱讀框，編碼形成一個(gè)205aa的蛋白，通過對(duì)氨基酸序列的分析證明都包含了Dmrt家族特有的DM結(jié)構(gòu)域——一個(gè)特殊的鋅指結(jié)構(gòu)。通過系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因分別屬于Dmrt11E和Dmrt99B分支，因此分別命名為MroDmrt11E和MroDmrt99B。
　　

6、 其次，采用半定量RT-PCR的方法研究這兩個(gè)基因在mRNA水平上的表達(dá)特征，結(jié)果表明羅氏沼蝦中兩個(gè)MroDmrt基因都表現(xiàn)出了明顯的性別特異性:MroDmrt11E主要在精巢中有高量表達(dá)，在兩性的神經(jīng)節(jié)中有一定程度的表達(dá)，在卵巢表達(dá)極低（少于精巢的1/10，P＜0.01）;而MroDmrt99B特異性的表達(dá)在精巢中且表達(dá)量較低。在胚胎發(fā)育過程中，兩個(gè)基因都呈現(xiàn)隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)行表達(dá)量隨之升高，相對(duì)的MroDmrt99B有一個(gè)滯后性。<