羅氏沼蝦lipocalin基因的功能研究.pdf

1、羅氏沼蝦是一種被廣泛養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)型淡水蝦。在日本、美國、以色列、東南亞和中國東南沿海被廣泛養(yǎng)殖，所以這是一種容易獲得的生物研究材料。它們成體的體色絢麗，在不同的時(shí)期呈現(xiàn)不同的特征，而且體色的變化與生長(zhǎng)和生殖以及相對(duì)應(yīng)的生長(zhǎng)蛻皮和生殖蛻皮有著密切的關(guān)系。若從體色變化著手去研究甲殼動(dòng)物的生殖與生長(zhǎng)的關(guān)系將具有可觀的應(yīng)用價(jià)值。本文就以該切入點(diǎn)對(duì)羅氏沼蝦lipocalin蛋白家族的MLC基因進(jìn)行了一系列研究。
　　 首先，我們通過設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并

2、引物獲得了羅氏沼蝦的lipocalin(載脂蛋白)家族基因MCL(Macrobrachium rosenbergii lipocalin)的片段，并通過設(shè)計(jì)核酸探針從已有的羅氏沼蝦cDNA文庫中篩選到了一個(gè)全長(zhǎng)cDNA。MLC基因cDNA長(zhǎng)726bp，具有609bp的開放閱讀框(ORF)，其翻譯的多肽經(jīng)過預(yù)測(cè)顯示由17個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽和203個(gè)氨基酸殘基的成熟肽組成。
　　 第二，我們通過核酸探針進(jìn)行Northern印記實(shí)驗(yàn)

3、獲得了該基因在羅氏沼蝦身體各部位和生命周期各個(gè)階段的表達(dá)特性?；蜣D(zhuǎn)錄的量在表皮下脂肪組織(Subepidermal adipose tissue-SAT)中最高，其次是肝胰腺(Hepatopancreas-Hepa)和中樞神經(jīng)組織(Central nervoussystem-CNS)。以SAT組織樣品為例，我們發(fā)現(xiàn)從幼蝦到成蝦轉(zhuǎn)錄逐漸增多。在成熟雌蝦的一個(gè)生殖蛻皮周期中，蛻皮后一天為MLC基因的轉(zhuǎn)錄最高峰。初步判定在羅氏沼蝦中MLC和

4、生長(zhǎng)與生殖蛻皮有著密切的相關(guān)性。
　　 第三，為了研究MLC基因的功能，我們采用RNA干涉的方法，使該基因表達(dá)水平降低。通過原核表達(dá)，我們制作了MLC的多克隆抗體，并用抗體檢測(cè)了沼蝦體內(nèi)的MLC干涉效率。結(jié)果顯示，隨著注射雙鏈RNA(dsRNA)劑量加大，干涉效率逐漸提高。以4μg/g(dsRNA/蝦重)的劑量為例，兩周后干涉效率達(dá)到90％。干涉后4周，蝦體整體上全部變紅，說明干涉使得結(jié)合蝦青素的MLC減少，多余的游離態(tài)蝦青素呈

5、現(xiàn)其本身的橘紅色。免疫膠體金透射電子顯微鏡(TEM)結(jié)果顯示，MLC主要分布在緊貼著外殼的表皮下脂肪組織內(nèi)的脂肪粒中。與干涉組相比，干涉后外殼中非細(xì)胞橫紋結(jié)構(gòu)中脂肪粒減少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)脂肪粒中的MLC蛋白也相應(yīng)的減少了。這些結(jié)果表明MLC是通過在脂肪顆粒中結(jié)合蝦青素而形成各種體色的。
　　 第四，為了探究MLC基因的結(jié)合配體，我們進(jìn)行了原核重組MLC蛋白體外結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)。在配體與蛋白的混合溶液中我們加入鎳珠，通過融合表達(dá)的His6標(biāo)

6、簽將蛋白結(jié)合沉淀下來。經(jīng)過洗滌和洗脫后，我們用丙酮抽提配體并進(jìn)行高效液相色譜分析。結(jié)果顯示，MLC蛋白能和蝦青素分子、蛻皮激素分子(20-hydroxyecdysone，20-HE)在體外結(jié)合，結(jié)合率分別為1:0.29與1:0.12。
　　 綜上所述，我們認(rèn)為MLC蛋白通過結(jié)合蝦青素來調(diào)節(jié)羅氏沼蝦的體色形成。MLC在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；MLC在皮下脂肪組織中的表達(dá)量隨著蛻皮周期的變化而變化；以及MLC在體外能夠結(jié)合蛻皮激素