豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒感染人源細(xì)胞全基因克隆與序列分析.pdf

1、豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒感染人源細(xì)胞全基因克隆與序列分析中文摘要豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(porcineendogenousretrovirus,PERV)是單股正鏈RNA病毒，以前病毒的形式整合在宿主基因組中。由于豬的心血管、消化、皮膚等系統(tǒng)與人類具有較大的相似性，一直是人類異種器官移植的首選供體。事實(shí)上，醫(yī)生早已在使用豬的不同成分如心臟瓣膜、凝結(jié)因子、胰島細(xì)胞治療人類疾病。盡管據(jù)調(diào)查接受活豬組織的人體細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)活性PERV感染的證據(jù)，但自從19

2、97年P(guān)atience等發(fā)現(xiàn)PERV在體外可以感染多種人源細(xì)胞以來，豬→人異種移植的PERV安全性問題引起了人們廣泛關(guān)注。 本實(shí)驗(yàn)是在建立的五指山小型豬(WZS)外周血(PBL)中的PERV感染人胚腎(HEK293)細(xì)胞感染模型的基礎(chǔ)上，對PERV的存在進(jìn)行鑒定并對其cDNA全基因進(jìn)行克隆和序列分析，為進(jìn)一步構(gòu)建PERV感染性cDNA克隆，深入研究PERV對人源細(xì)胞的感染、整合、與調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。依據(jù)豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(PER

3、V)WZS株全基因組序列，利用primer5.0軟件設(shè)計合成了覆蓋全長的5對重疊引物。其中5’端上游引物P1F中，在5’末端引入了病毒基因組中沒有的SacI酶切位點(diǎn)和T7啟動子核心序列，以便用T7RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。在5’末端還引入一個與病毒5’末端直接相連的外源G，提高轉(zhuǎn)錄效率，方便體外轉(zhuǎn)錄時完成5’端加帽反應(yīng)。在3’端下游引物P5R中，為使全基因克隆轉(zhuǎn)錄體3’端具有感染性，在3’末端引入了30個腺苷酸(A)，同時在3’末端引入

4、病毒基因組中沒有的ClaI酶切位點(diǎn)，便于轉(zhuǎn)錄時將基因組克隆質(zhì)粒線性化，使轉(zhuǎn)錄到該位點(diǎn)時，反應(yīng)被人為終止，從而得到預(yù)期的病毒基因組RNA分子。培養(yǎng)PERV-WZS-293細(xì)胞，利用異硫胍酸鹽方法制備總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)加入反向引物，按SuperscriptⅢ反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書進(jìn)行cDNA合成，以cDNA為模板利用5對重疊引物擴(kuò)增出P1、P2、P3、P4及P5各cDNA重疊片段，運(yùn)用RT-PCR技術(shù)獲得

5、覆蓋全長PERV-WZS-293細(xì)胞全基因的5個DNA重疊片段，大小分別為1078bp、1817bp、2492bp、1766bp和2490bp。PCR產(chǎn)物于1％瓊脂糖凝膠電泳純化、回收，用T4DNALigase將PCR產(chǎn)物連接，其中P1、P2、P3用pGEM-Tvector，P4用pMD18-TVector，P5用pWSK29，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于DH5α感受態(tài)菌，利用藍(lán)白斑篩選陽性重組子進(jìn)行PCR及酶切鑒定，最后挑取陽性克隆測序。將P