豬流行性腹瀉病毒的分離、鑒定及全基因序列分析.pdf

1、豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種急性傳染病，可引起豬只急性腹瀉并迅速脫水、死亡，對哺乳仔豬危害最大。近年來，PED在世界各地頻繁爆發(fā)。眾多研究表明，PEDV變異是導(dǎo)致疫情加劇的主要原因。因此對變異毒株開展組織培養(yǎng)特性、病理學(xué)特性、分子生物學(xué)特性的系統(tǒng)研究具有重要意義。
　　本研究以采自四

2、川峨眉某豬場疑似PEDV感染仔豬的小腸及內(nèi)容物作病料，經(jīng)RT-PCR檢測，選擇PEDV陽性病料按常規(guī)方法處理后接種Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，并在細(xì)胞維持液中按5μg/mL量加入胰酶，盲傳至出現(xiàn)典型細(xì)胞病變。結(jié)果在第5代開始出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)，傳至第25代可在接毒后20 h穩(wěn)定出現(xiàn)典型CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓和變亮、顆粒物變多、細(xì)胞融合、細(xì)胞脫落、死亡并形成拉網(wǎng)狀，對分離毒進(jìn)行挑斑純化。經(jīng)RT-PCR檢測和S基因測序證實本研究成功分離了

3、PEDV毒株，將其命名為EM-P株。經(jīng)測定病毒的TCID50為1×10-6.5/mE。
　　將分離株EM-P口服接種1周齡哺乳仔豬，成功建立PED病理模型。相應(yīng)組織器官病理組織學(xué)觀察顯示， PEDV EM-P株所致感染呈持續(xù)性、多臟器性，且主要損傷腸道、腸系膜淋巴結(jié)、肺、脾。剖檢病理變化表現(xiàn)為腸壁變薄、充血，腸上皮細(xì)胞脫落;腸系膜淋巴充血，淋巴細(xì)胞減少、細(xì)胞空泡變性;肺邊緣貧血，局部淤血、水腫，肺泡融合;脾邊緣變薄呈半透明狀，白髓

4、萎縮等。利用PEDV N基因和內(nèi)參基因GAPDH基因建立了qRT-PCR方法，并用該方法對相應(yīng)組織進(jìn)行病毒載量檢測，結(jié)果在腸、腸系膜淋巴結(jié)、肺、脾中病毒載量最高，而且感染時間早、持續(xù)時間長。以上研究結(jié)果表明感染仔豬病理損傷程度與病毒載量呈正相關(guān)。
　　參照Genebank已公布的PEDV CV777株全基因序列，設(shè)計18對引物，對EM-P株進(jìn)行全基因分段克隆。EM-P株接種Vero細(xì)胞至75％以上細(xì)胞出現(xiàn)CPE后，提取總RNA為模

5、板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到18個片段，經(jīng)克隆、測序及拼接，獲得EM-P株全基因組（cDNA）序列。基因組全長28029 bp，經(jīng)與已報道6個代表毒株進(jìn)行比對分析，結(jié)果顯示EM-P株具有典型的PEDV基因組特征，與參考毒株同源性在97.3％-98.2％。以PEDV CV777株為參考對各基因序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示EM-P株S1基因、ORF1基因等出現(xiàn)明顯變異，推測其可能導(dǎo)致毒株免疫原性和病毒復(fù)制能力等生物特性改變。而EM-P株ORF3基因