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文檔簡介
1、豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一種急性傳染病,可引起豬只急性腹瀉并迅速脫水、死亡,對哺乳仔豬危害最大。近年來,PED在世界各地頻繁爆發(fā)。眾多研究表明,PEDV變異是導致疫情加劇的主要原因。因此對變異毒株開展組織培養(yǎng)特性、病理學特性、分子生物學特性的系統(tǒng)研究具有重要意義。
本研究以采自四
2、川峨眉某豬場疑似PEDV感染仔豬的小腸及內(nèi)容物作病料,經(jīng)RT-PCR檢測,選擇PEDV陽性病料按常規(guī)方法處理后接種Vero細胞進行病毒分離,并在細胞維持液中按5μg/mL量加入胰酶,盲傳至出現(xiàn)典型細胞病變。結(jié)果在第5代開始出現(xiàn)細胞病變(CPE),傳至第25代可在接毒后20 h穩(wěn)定出現(xiàn)典型CPE,表現(xiàn)為細胞變圓和變亮、顆粒物變多、細胞融合、細胞脫落、死亡并形成拉網(wǎng)狀,對分離毒進行挑斑純化。經(jīng)RT-PCR檢測和S基因測序證實本研究成功分離了
3、PEDV毒株,將其命名為EM-P株。經(jīng)測定病毒的TCID50為1×10-6.5/mE。
將分離株EM-P口服接種1周齡哺乳仔豬,成功建立PED病理模型。相應組織器官病理組織學觀察顯示, PEDV EM-P株所致感染呈持續(xù)性、多臟器性,且主要損傷腸道、腸系膜淋巴結(jié)、肺、脾。剖檢病理變化表現(xiàn)為腸壁變薄、充血,腸上皮細胞脫落;腸系膜淋巴充血,淋巴細胞減少、細胞空泡變性;肺邊緣貧血,局部淤血、水腫,肺泡融合;脾邊緣變薄呈半透明狀,白髓
4、萎縮等。利用PEDV N基因和內(nèi)參基因GAPDH基因建立了qRT-PCR方法,并用該方法對相應組織進行病毒載量檢測,結(jié)果在腸、腸系膜淋巴結(jié)、肺、脾中病毒載量最高,而且感染時間早、持續(xù)時間長。以上研究結(jié)果表明感染仔豬病理損傷程度與病毒載量呈正相關(guān)。
參照Genebank已公布的PEDV CV777株全基因序列,設(shè)計18對引物,對EM-P株進行全基因分段克隆。EM-P株接種Vero細胞至75%以上細胞出現(xiàn)CPE后,提取總RNA為模
5、板,經(jīng)RT-PCR擴增得到18個片段,經(jīng)克隆、測序及拼接,獲得EM-P株全基因組(cDNA)序列。基因組全長28029 bp,經(jīng)與已報道6個代表毒株進行比對分析,結(jié)果顯示EM-P株具有典型的PEDV基因組特征,與參考毒株同源性在97.3%-98.2%。以PEDV CV777株為參考對各基因序列進行分析,結(jié)果顯示EM-P株S1基因、ORF1基因等出現(xiàn)明顯變異,推測其可能導致毒株免疫原性和病毒復制能力等生物特性改變。而EM-P株ORF3基因
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