豬戊型肝炎病毒感染性克隆及復制子的構建.pdf

1、戊型肝炎是由戊型肝炎病毒引起的一種急性、自限性人畜共患傳染病,該病主要經糞-口途徑傳播,臨床病變以黃疸為主。主要暴發(fā)于發(fā)展中國家。
　　 繼1988-1989年我國新疆暴發(fā)戊型肝炎后,該病在我國開始散在分布。1997年,美國學者Meng等首次在豬血清中分離到戊型肝炎病毒,隨后在其他各國也相繼報道了豬的戊型肝炎病毒,主要是HEV基因Ⅲ型和Ⅳ型,在我國養(yǎng)豬業(yè)以基因型Ⅳ型為主。本實驗室檢測并分離到的戊型肝炎病毒從屬于基因Ⅳ型,相關報道

2、顯示,人所感染的戊型肝炎病毒的基因序列與豬的戊型肝炎病毒的基因序列相比,基因Ⅳ型的同源性最高。
　　 由于缺乏有效的體外培養(yǎng)系統(tǒng),對戊型肝炎病毒的復制及其轉錄機制的研究進展相當緩慢。為了打破這一瓶頸,panda等在2000年引入了感染性克隆技術。鑒于以上基礎,本實驗對在華中地區(qū)戊型肝炎陽性病料中的病毒進行了感染性克隆以及復制子的研究,主要內容包括:
　　 (1)戊型肝炎病毒感染性克隆質粒的構建
　　 在已經測通的

3、WH09株HEV的全基因組序列的基礎上,將HEV的全長分割成5個片段分別設計引物進行克隆,測序,序列比對正確后將其按照全長基因組的順序依次連在pCDNA3.1載體上,得到了含有戊型肝炎病毒全基因組的重組質粒。
　　 (2)戊型肝炎病毒感染性克隆質?；謴筒《净钚缘尿炞C
　　 將質粒在末端(載體上)線性化,純化后轉染肝癌細胞PLC/PRF/5,進一步通過RT-PCR方法檢測到戊型肝炎病毒能夠在細胞中復制三代,且隨著復制代數增

4、加其活性也會逐漸消失,通過IFA的方法能夠檢測到病毒蛋白的表達。
　　 (3)戊型肝炎病毒的復制子質粒的構建與復制能力的恢復驗證
　　 在戊型肝炎病毒的全基因組中缺失掉部分結構基因,插入易于檢測的外源基因,構建了分別含有外源基因IRES-EGFP、IRES—Luc的復制子,進行驗證,含有IRES-EGFP的復制子沒能找到發(fā)光的細胞,結果顯示含有IRES-Luc的復制子經過雙熒光素酶的檢測能夠檢測到Luc的表達,對缺失掉O