澤蘭尾孢菌殺草毒素的初步研究.pdf

1、紫莖澤蘭(EupatoriumadenophorumSpreng．)是目前世界上重要的惡性雜草之一。長(zhǎng)期以來(lái)對(duì)該雜草的防治進(jìn)行了大量的研究并已取得一定成果，但是現(xiàn)有的控制方法仍然沒(méi)有完全阻止該雜草的擴(kuò)展蔓延。研究獲得有效的防治方法和新型除草劑仍然是該雜草研究關(guān)注的熱點(diǎn)。 微生物及其代謝產(chǎn)物除草是目前新型除草劑研發(fā)的一個(gè)重點(diǎn)，本研究分離自然狀態(tài)下紫莖澤蘭葉片壞死組織中的微生物，以紫莖澤蘭為模型，篩選出產(chǎn)毒微生物，獲得對(duì)紫莖澤蘭具有

2、強(qiáng)致病力的產(chǎn)毒菌株。在此基礎(chǔ)上探索該菌株的最適產(chǎn)毒條件，研究該菌株產(chǎn)生毒素的基本性質(zhì)，并對(duì)毒素進(jìn)行分離、純化，為利用真菌毒素控制紫莖澤蘭和新型生物源除草劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下： (1)紫莖澤蘭葉片壞死組織相關(guān)微生物分離。本試驗(yàn)以云南省六個(gè)不同采集地的紫莖澤蘭壞死組織為材料，分離得到98個(gè)微生物菌株。經(jīng)初步鑒定分別為：尾孢菌Cercosporaspp．(35株)，鏈格孢Alternariaspp．(18株)，青霉Pen

3、icillinumspp．(5株)，根霉Rhizopusspp．(8株)，曲霉Aspergillusspp．(4株)，細(xì)菌(8株)，其它(20株)。顯示尾孢菌是云南省紫莖澤蘭葉片壞死組織的優(yōu)勢(shì)菌株。 (2)菌絲接種試驗(yàn)表明：編號(hào)為GM003、GM017、GM032、GM044、GM095、GM096、GM097、GM098的菌株能夠使離體紫莖澤蘭葉片針刺處產(chǎn)生典型的葉斑病病斑。通過(guò)對(duì)各病組織進(jìn)行再次分離，均分離出原接種菌株，證明

4、這8個(gè)菌株屬紫莖澤蘭的病原菌。 (3)代謝產(chǎn)物活性生物檢測(cè)。用離體紫莖澤蘭葉片作生測(cè)材料，采用針刺法對(duì)分離出的98個(gè)菌株發(fā)酵代謝產(chǎn)物進(jìn)行活性篩選，發(fā)現(xiàn)有16個(gè)菌株(編號(hào)為GM003、GM017、GM032，GM044、GM053，GM059、GM063、GM070、GM076、GM079、GM083、GM086、GM095、GM096、GM097、GM098)能夠產(chǎn)生對(duì)紫莖澤蘭有傷害作用的毒素。通過(guò)傷害活性對(duì)比認(rèn)為，GM017號(hào)

5、菌株對(duì)離體紫莖澤蘭葉片傷害作用最大，最具有研究和應(yīng)用潛力。因此，本論文選用GM017號(hào)菌株作為殺草活性代謝產(chǎn)物研究的材料。通過(guò)對(duì)GM017號(hào)菌株培養(yǎng)性狀和顯微特征的觀察描述、顯微計(jì)測(cè)和繪圖，查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，并與郭光遠(yuǎn)等人對(duì)澤蘭尾孢菌的描述對(duì)比，確定為澤蘭尾孢菌(CercosporaeupatoriiPeck．)。 (4)用離體紫莖澤蘭葉片作生測(cè)材料，對(duì)澤蘭尾孢菌的產(chǎn)毒條件進(jìn)行優(yōu)化研究，結(jié)果表明：PD培養(yǎng)液最利于澤蘭尾孢菌產(chǎn)毒。

6、在PD培養(yǎng)液中加入寄主紫莖澤蘭葉汁不能對(duì)毒素的產(chǎn)生和活性起促進(jìn)作用，相反在一定程度上起抑制作用。澤蘭尾孢菌在培養(yǎng)液初始pH值為中性的PD培養(yǎng)液中，采用自然晝夜交替的光照條件和全振蕩的培養(yǎng)方式發(fā)酵8d產(chǎn)毒量最高。 (5)澤蘭尾孢菌毒素粗提液的基本性質(zhì)研究顯示：毒素有較高的耐熱性，經(jīng)12l℃滅菌處理20min后，仍未出現(xiàn)失活現(xiàn)象；在改變毒素粗提液的pH后，澤蘭尾孢菌毒素致病活性隨著pH的增加而減小。該毒素能溶于甲醇、無(wú)水乙醇等極性強(qiáng)

7、的有機(jī)溶劑，而不溶于乙酸乙酯、石油醚等極性弱有機(jī)溶劑，說(shuō)明該毒素是一類極性較大的物質(zhì)。 (6)澤蘭尾孢菌毒素?；匝芯勘砻鳎簼商m尾孢菌毒素對(duì)寄主植物(紫莖澤蘭)有傷害作用，對(duì)幾種常見(jiàn)的非寄主雜草也有不同程度的傷害作用，這說(shuō)明該毒素是一種非寄主專化性毒素，具有廣譜的除草能力。另外，紫莖澤蘭幼葉對(duì)毒素反應(yīng)快速、靈敏，且能產(chǎn)生典型的受害癥狀，是一種理想的生測(cè)材料。這些研究結(jié)果對(duì)于今后利用該毒素除草有一定指導(dǎo)意義。生測(cè)方法研究顯示，與浸

8、漬法、涂抹法相比，針刺法不僅反應(yīng)速度快，而且用量少。 (7)采用系統(tǒng)溶劑法初步分離澤蘭尾孢菌粗毒素，用生測(cè)活性最強(qiáng)的無(wú)水乙醇萃取物進(jìn)行硅膠柱層析(氯仿．甲醇梯度洗脫)，再結(jié)合重結(jié)晶的方法，得到對(duì)紫莖澤蘭有強(qiáng)致病活性的無(wú)色晶體；該晶體熔程為104~C~107~C，易溶于甲醇、無(wú)水乙醇、丙酮，在乙酸乙酯、氯仿中溶解性差，僅溶解少許毒素晶體，在石油醚中溶解性極??；定性鑒定研究表明：排除該晶體屬于糖及其甙類、酚類、鞣質(zhì)、生物堿、皂甙、黃