柑橘膠孢炭疽菌毒素的粗提取及致病性研究.pdf

1、炭疽病是嚴(yán)重影響柑橘采后貯藏的重要病害，半知菌亞門炭疽菌屬的膠孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)為柑橘炭疽病的主要致病菌，有較強(qiáng)的致病能力，能引起貯藏期間的柑橘產(chǎn)生病斑甚至腐爛，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前國內(nèi)對柑橘炭疽病的研究主要集中于病原菌的生長特性及其拮抗菌篩選等方面，對于膠孢炭疽菌毒素致病性的報(bào)道較少。國外有關(guān)膠孢炭疽菌毒力大小的研究指出環(huán)境pH、病原菌的分泌蛋白和編碼與致病力有關(guān)的基因是病原菌

2、的毒力因子，改變pH等條件會影響病原菌的致病力。然而，這些報(bào)道主要集中在毒素的產(chǎn)生條件、結(jié)構(gòu)分析和是否具有寄主專化性等。本試驗(yàn)研究了膠孢炭疽菌的最佳產(chǎn)毒培養(yǎng)基以探究最適產(chǎn)毒因子；毒素的粗提取以及粗毒素對柑橘顯微結(jié)構(gòu)以及生理代謝的影響以探究毒素的致病性；對羥基苯甲酸對采后柑橘的抗性誘導(dǎo)以探究柑橘貯藏的新方式等。主要研究結(jié)果如下：
　　1、體外培養(yǎng)膠孢炭疽菌，通過改變培養(yǎng)基的類型和成分來研究最佳產(chǎn)毒培養(yǎng)基。研究表明：不同類型的培養(yǎng)基中

3、察氏培養(yǎng)基產(chǎn)生的毒素能在柑橘上形成較大病斑；改變察氏培養(yǎng)基中碳源、氮源和無機(jī)鹽的種類可以影響毒素的生成，最佳的碳源為果糖，氮源為硝酸鈉，無機(jī)鹽為磷酸氫二鉀；通過四因素四水平正交實(shí)驗(yàn)研究產(chǎn)毒的最適培養(yǎng)條件，分別為溫度30℃，時(shí)間19天，轉(zhuǎn)速100 r/min，pH為8。在此條件下產(chǎn)生的病斑直徑為5.39±0.22 mm。
　　2、在最適產(chǎn)毒培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，通過比較硫酸銨分級沉淀法和不同極性有機(jī)溶劑浸提法來研究膠孢炭疽菌毒素的粗提取，

4、得出甲醇浸提后得到的上清液能產(chǎn)生最大的病斑。經(jīng)基本化學(xué)本質(zhì)分析得出粗毒素含有的主要成分為酮糖、蛋白或氨基酸等極性物質(zhì)。高溫和改變pH值均會影響粗毒素的活性。
　　3、將得到的粗毒素配制成不同的濃度以研究粗毒素對柑橘果皮顯微結(jié)構(gòu)的影響，得出隨著粗毒素濃度的增加以及培養(yǎng)時(shí)間的延長，粗毒素對柑橘果實(shí)細(xì)胞造成的傷害也越大，果皮細(xì)胞呈現(xiàn)出皺縮和破裂的形態(tài)。其原因可能是粗毒素中含有能夠水解細(xì)胞壁的相關(guān)酶類以及某些致病成分。
　　4、研究

5、粗毒素對柑橘生理代謝的影響可知：膠孢炭疽菌粗毒素能使柑橘果實(shí)產(chǎn)生典型的病斑癥狀，且使丙二醛含量顯著增高，細(xì)胞壁成分含量降低。當(dāng)毒素濃度較低時(shí)，果實(shí)病斑直徑與多酚氧化酶活性、過氧化物酶活性、類黃酮以及木質(zhì)素含量呈正相關(guān)；與纖維素、半纖維素和果膠含量呈負(fù)相關(guān)。毒素濃度增高時(shí)，果實(shí)機(jī)體及防御酶系統(tǒng)遭到破壞，酶活急劇下降。膠孢炭疽菌粗毒素能影響柑橘果實(shí)生理代謝，引起果實(shí)發(fā)病，最終導(dǎo)致病斑的形成。由此證明毒素在膠孢炭疽菌對柑橘的致病過程中起到重要

6、作用。
　　5、對羥基苯甲酸能夠誘導(dǎo)采后柑橘果實(shí)的抗性，延長柑橘保質(zhì)期。試驗(yàn)中可知對羥基苯甲酸對采后柑橘炭疽病病原菌有較強(qiáng)的抑菌活性，濃度越高，對病原菌的抑制作用越強(qiáng)。經(jīng)對羥基苯甲酸處理的柑橘果實(shí)中，抗性相關(guān)酶活性升高，丙二醛含量下降。并且對羥基苯甲酸誘導(dǎo)的抗性相關(guān)酶在整個(gè)試驗(yàn)過程中維持較高的活性。對羥基苯甲酸處理對采后柑橘炭疽病病原菌有較強(qiáng)的抗菌作用，能提高柑橘果實(shí)相關(guān)抗性酶活性以及抑制膜脂過氧化反應(yīng)，誘導(dǎo)其果實(shí)抗性。對柑橘采后