超量表達(dá)AtDWF4基因?qū)娌松L(zhǎng)發(fā)育及抗寒性的影響.pdf

1、植物激素在植株生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，對(duì)植物生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老、休眠以及抗逆性都具有重要的影響。油菜素甾醇是最近新確認(rèn)的植物激素，被稱為繼生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯之后的第六大植物激素，廣泛參與植物細(xì)胞伸長(zhǎng)、維管分化、根生長(zhǎng)、光反應(yīng)、抗逆、衰老等方面的調(diào)控。
　　油菜素甾醇（BR）通過(guò)復(fù)雜的平行和交互代謝網(wǎng)絡(luò)代謝途徑，將植物甾醇前體成分轉(zhuǎn)變?yōu)樯锘钚缘溺尥约坝筒怂貎?nèi)酯。擬南芥DWF4基因編碼一個(gè)P450細(xì)胞色素氧

2、化酶，催化BR的C-22羥基化反應(yīng)。該反應(yīng)是油菜素甾醇生物合成途徑中的限速步驟，決定最終BR的合成數(shù)量。
　　芥菜（Brassica juncea Coss.）是重要的十字花科蔬菜作物，在我國(guó)西南地區(qū)及長(zhǎng)江流域擁有廣泛的栽培面積。本論文擬在莖用芥菜中超量表達(dá)來(lái)自擬南芥的DWF4基因，研究DWF4基因?qū)娌酥仓晟L(zhǎng)發(fā)育以及植株抗寒能力的影響，實(shí)現(xiàn)芥菜生物產(chǎn)量、種子產(chǎn)量以及抗寒性能力的提高。獲得的主要研究結(jié)果如下：
　　1、DW

3、F4轉(zhuǎn)基因芥菜的獲得
　　通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將表達(dá)載體pCABarDWF4轉(zhuǎn)化芥菜，經(jīng)含8mg/L草丁膦（PPT）篩選培養(yǎng)基多次篩選，獲得了pCABarDWF4轉(zhuǎn)基因芥菜植株。轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定結(jié)果DWF4目的基因已被成功整合到芥菜基因組中。
　　2、pCABarDWF4轉(zhuǎn)基因植株除草劑抗性以及DWF4基因的表達(dá)分析
　　pCABarDWF4轉(zhuǎn)基因芥菜后代和非轉(zhuǎn)基因野生型芥菜，在苗期分別使用500mg/L濃度的PPT

4、進(jìn)行處理，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株后代具有明顯的抗除草劑能力。除草劑抗性植株進(jìn)行DWF4基因的表達(dá)分析，結(jié)果顯示DWF4基因在不同轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)各有差異，其中在D2、D3植株中表達(dá)水平較高。
　　3、T2代pCABarDWF4轉(zhuǎn)基因芥菜苗期光照、黑暗條件下生長(zhǎng)情況
　　獲得的轉(zhuǎn)基因植株苗期在光照和黑暗處理?xiàng)l件下的下胚軸長(zhǎng)和根長(zhǎng)都不同程度高于對(duì)照野生型，說(shuō)明DWF4基因超表達(dá)后可以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株苗期的生長(zhǎng)發(fā)育。
　　4、

5、T2代pCABarDWF4轉(zhuǎn)基因芥菜苗期BR抑制劑PCZ處理
　　pCABarDWF4轉(zhuǎn)基因芥菜種子置于50μmol PCZ（油菜素內(nèi)酯抑制劑）處理后，其根長(zhǎng)和下胚軸長(zhǎng)度均明顯高于對(duì)照野生型，表明轉(zhuǎn)基因植株抗PCZ抑制生長(zhǎng)效果更好，也進(jìn)一步說(shuō)明DWF4基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)可提高油菜素內(nèi)酯合成和積累。
　　5、T2代pCABarDWF4轉(zhuǎn)基因芥菜植株生長(zhǎng)發(fā)育情況和結(jié)莢、結(jié)種數(shù)調(diào)查
　　pCABarDWF4轉(zhuǎn)基因芥菜植株

6、生長(zhǎng)迅速，生長(zhǎng)勢(shì)旺盛，其葉、花等器官都大于對(duì)照野生型。轉(zhuǎn)基因植株成長(zhǎng)過(guò)程中，其株高、開展度、最大葉寬、最大葉長(zhǎng)都顯著高于野生型。轉(zhuǎn)基因植株抽薹時(shí)間和開花時(shí)間提前。pCABarDWF4轉(zhuǎn)基因芥菜植株與野生型植株相比，結(jié)莢枝更長(zhǎng)，分枝變多，結(jié)莢數(shù)增多，種莢率變高，結(jié)種數(shù)增加。
　　6、BR生物合成結(jié)構(gòu)基因以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的表達(dá)分析
　　分別對(duì)轉(zhuǎn)基因植株BR生物合成結(jié)構(gòu)基因以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植

7、株中除CPD基因表達(dá)量出現(xiàn)明顯下調(diào)外，DET2、ROT3和CYP85A2基因表達(dá)量均較對(duì)照野生型出現(xiàn)明顯的上調(diào)表達(dá)。而針對(duì)BR生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的表達(dá)分析顯示，除BAS1基因外，其余的BAK1（BRI1）、BES1、BZR1、BIN2和BSKs基因表達(dá)量均高于對(duì)照野生型。上述結(jié)果顯示超表達(dá)DWF4基因后影響了BR生物合成途徑中相關(guān)結(jié)構(gòu)基因以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)源BR水平提高而促進(jìn)植株生長(zhǎng)發(fā)育以及結(jié)籽數(shù)量的增加。
　　7、

8、T2代pCABarDWF4轉(zhuǎn)基因芥菜苗期生長(zhǎng)素相關(guān)基因RT-PCR分析和生長(zhǎng)素抑制劑TIBA處理
　　在DWF4轉(zhuǎn)基因芥菜植株中，生長(zhǎng)素合成基因ARF2和ARF7基因表達(dá)水平相對(duì)野生型出現(xiàn)明顯上升。轉(zhuǎn)基因芥菜種子置于5μmol TIBA（生長(zhǎng)素抑制劑）處理后，轉(zhuǎn)基因植株根以及下胚軸生長(zhǎng)受到抑制程度遠(yuǎn)低于野生型對(duì)照，說(shuō)明DWF4基因超表達(dá)后導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)源BR積累水平上升，促進(jìn)參內(nèi)源生長(zhǎng)素的合成，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株受生長(zhǎng)素抑制劑TIBA的影

9、響降低。
　　8、T2代pCABarDWF4轉(zhuǎn)基因芥菜植株的抗寒性分析
　　在6℃低溫下，T2代pCABarDWF4轉(zhuǎn)基因芥菜苗期根和下胚軸的生長(zhǎng)均明顯高于野生型。將轉(zhuǎn)基因植株置于4℃低溫處理后，轉(zhuǎn)基因植株相對(duì)電導(dǎo)率明顯低于野生型，而脯氨酸積累量則明顯高于對(duì)照野生型，且處理后的轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株恢復(fù)生長(zhǎng)更快。顯示超表達(dá)DWF4基因具有明顯促進(jìn)植株抗寒的作用。進(jìn)一步針對(duì)轉(zhuǎn)基因植株抗寒相關(guān)基因的表達(dá)分析顯示：CBF1-3，I