超量表達AtDWF4基因?qū)娌松L發(fā)育及抗寒性的影響.pdf

1、植物激素在植株生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，對植物生長、發(fā)育、衰老、休眠以及抗逆性都具有重要的影響。油菜素甾醇是最近新確認的植物激素，被稱為繼生長素、細胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯之后的第六大植物激素，廣泛參與植物細胞伸長、維管分化、根生長、光反應(yīng)、抗逆、衰老等方面的調(diào)控。
　　油菜素甾醇（BR）通過復(fù)雜的平行和交互代謝網(wǎng)絡(luò)代謝途徑，將植物甾醇前體成分轉(zhuǎn)變?yōu)樯锘钚缘溺尥约坝筒怂貎?nèi)酯。擬南芥DWF4基因編碼一個P450細胞色素氧

2、化酶，催化BR的C-22羥基化反應(yīng)。該反應(yīng)是油菜素甾醇生物合成途徑中的限速步驟，決定最終BR的合成數(shù)量。
　　芥菜（Brassica juncea Coss.）是重要的十字花科蔬菜作物，在我國西南地區(qū)及長江流域擁有廣泛的栽培面積。本論文擬在莖用芥菜中超量表達來自擬南芥的DWF4基因，研究DWF4基因?qū)娌酥仓晟L發(fā)育以及植株抗寒能力的影響，實現(xiàn)芥菜生物產(chǎn)量、種子產(chǎn)量以及抗寒性能力的提高。獲得的主要研究結(jié)果如下：
　　1、DW

3、F4轉(zhuǎn)基因芥菜的獲得
　　通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將表達載體pCABarDWF4轉(zhuǎn)化芥菜，經(jīng)含8mg/L草丁膦（PPT）篩選培養(yǎng)基多次篩選，獲得了pCABarDWF4轉(zhuǎn)基因芥菜植株。轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定結(jié)果DWF4目的基因已被成功整合到芥菜基因組中。
　　2、pCABarDWF4轉(zhuǎn)基因植株除草劑抗性以及DWF4基因的表達分析
　　pCABarDWF4轉(zhuǎn)基因芥菜后代和非轉(zhuǎn)基因野生型芥菜，在苗期分別使用500mg/L濃度的PPT

4、進行處理，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株后代具有明顯的抗除草劑能力。除草劑抗性植株進行DWF4基因的表達分析，結(jié)果顯示DWF4基因在不同轉(zhuǎn)基因植株中的表達各有差異，其中在D2、D3植株中表達水平較高。
　　3、T2代pCABarDWF4轉(zhuǎn)基因芥菜苗期光照、黑暗條件下生長情況
　　獲得的轉(zhuǎn)基因植株苗期在光照和黑暗處理條件下的下胚軸長和根長都不同程度高于對照野生型，說明DWF4基因超表達后可以促進轉(zhuǎn)基因植株苗期的生長發(fā)育。
　　4、

5、T2代pCABarDWF4轉(zhuǎn)基因芥菜苗期BR抑制劑PCZ處理
　　pCABarDWF4轉(zhuǎn)基因芥菜種子置于50μmol PCZ（油菜素內(nèi)酯抑制劑）處理后，其根長和下胚軸長度均明顯高于對照野生型，表明轉(zhuǎn)基因植株抗PCZ抑制生長效果更好，也進一步說明DWF4基因在植物細胞中的表達可提高油菜素內(nèi)酯合成和積累。
　　5、T2代pCABarDWF4轉(zhuǎn)基因芥菜植株生長發(fā)育情況和結(jié)莢、結(jié)種數(shù)調(diào)查
　　pCABarDWF4轉(zhuǎn)基因芥菜植株

6、生長迅速，生長勢旺盛，其葉、花等器官都大于對照野生型。轉(zhuǎn)基因植株成長過程中，其株高、開展度、最大葉寬、最大葉長都顯著高于野生型。轉(zhuǎn)基因植株抽薹時間和開花時間提前。pCABarDWF4轉(zhuǎn)基因芥菜植株與野生型植株相比，結(jié)莢枝更長，分枝變多，結(jié)莢數(shù)增多，種莢率變高，結(jié)種數(shù)增加。
　　6、BR生物合成結(jié)構(gòu)基因以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的表達分析
　　分別對轉(zhuǎn)基因植株BR生物合成結(jié)構(gòu)基因以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)基因的表達情況進行了分析。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植

7、株中除CPD基因表達量出現(xiàn)明顯下調(diào)外，DET2、ROT3和CYP85A2基因表達量均較對照野生型出現(xiàn)明顯的上調(diào)表達。而針對BR生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的表達分析顯示，除BAS1基因外，其余的BAK1（BRI1）、BES1、BZR1、BIN2和BSKs基因表達量均高于對照野生型。上述結(jié)果顯示超表達DWF4基因后影響了BR生物合成途徑中相關(guān)結(jié)構(gòu)基因以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因的表達，導(dǎo)致內(nèi)源BR水平提高而促進植株生長發(fā)育以及結(jié)籽數(shù)量的增加。
　　7、

8、T2代pCABarDWF4轉(zhuǎn)基因芥菜苗期生長素相關(guān)基因RT-PCR分析和生長素抑制劑TIBA處理
　　在DWF4轉(zhuǎn)基因芥菜植株中，生長素合成基因ARF2和ARF7基因表達水平相對野生型出現(xiàn)明顯上升。轉(zhuǎn)基因芥菜種子置于5μmol TIBA（生長素抑制劑）處理后，轉(zhuǎn)基因植株根以及下胚軸生長受到抑制程度遠低于野生型對照，說明DWF4基因超表達后導(dǎo)致細胞內(nèi)源BR積累水平上升，促進參內(nèi)源生長素的合成，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株受生長素抑制劑TIBA的影

9、響降低。
　　8、T2代pCABarDWF4轉(zhuǎn)基因芥菜植株的抗寒性分析
　　在6℃低溫下，T2代pCABarDWF4轉(zhuǎn)基因芥菜苗期根和下胚軸的生長均明顯高于野生型。將轉(zhuǎn)基因植株置于4℃低溫處理后，轉(zhuǎn)基因植株相對電導(dǎo)率明顯低于野生型，而脯氨酸積累量則明顯高于對照野生型，且處理后的轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株恢復(fù)生長更快。顯示超表達DWF4基因具有明顯促進植株抗寒的作用。進一步針對轉(zhuǎn)基因植株抗寒相關(guān)基因的表達分析顯示：CBF1-3，I