利用可控表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究MSTN對肌肉生長發(fā)育的影響.pdf

1、MSTN是肌肉生長發(fā)育的一個重要的負(fù)調(diào)控因子，是影響體型發(fā)育的經(jīng)典基因之一，其表達(dá)量的增加與肌肉量的減少密切相關(guān)，抑制MSTN基因的功能，動物會呈現(xiàn)出雙肌表型，這對畜牧生產(chǎn)、動物遺傳育種、肌肉萎縮性疾病的診斷、治療和預(yù)后等方面具有重要意義，但MSTN是一個在胚胎早期就能表達(dá)的基因，胚胎期沉默或敲除MSTN基因會因肌肉過度肥大而造成難產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎。實現(xiàn)MSTN基因的可控表達(dá)成為發(fā)揮MSTN基因應(yīng)用價值的關(guān)鍵。本研究通過設(shè)計MSTN sh

2、RNA并驗證其基因沉默效率，構(gòu)建可控表達(dá)MSTN shRNA載體，制備高效可誘導(dǎo)MSTN shRNA表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，利用可控表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究MSTN對肌肉生長發(fā)育的影響，為將可控表達(dá)的MSTN基因應(yīng)用到基因工程育種、藥物治療肌肉萎縮病等方面奠定技術(shù)基礎(chǔ)，提供有價值的參考。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　研究一:小鼠MSTN shRNA過表達(dá)載體構(gòu)建及基因沉默效率檢測
　　本研究根據(jù)小鼠MSTN mRNA序列設(shè)計了4

3、對shRNA序列，構(gòu)建相應(yīng)的MSTN shRNA過表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo-MSTN shRNA，利用QRT-PCR、Western blot技術(shù)檢測shRNA干擾后細(xì)胞內(nèi)MSTN mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，本研究設(shè)計并構(gòu)建的4個MSTNshRNA過表達(dá)載體，在細(xì)胞水平都能有效降低MSTN mRNA及蛋白的表達(dá)水平，其中轉(zhuǎn)染pGPU6/GFP/Neo-MSTN714載體細(xì)胞組基因沉默效率最高，MSTN mRNA和蛋白表

4、達(dá)分別下降72％、74％，差異極顯著(P＜0.01)。
　　研究二:小鼠MSTN shRNA可控表達(dá)載體構(gòu)建及誘導(dǎo)效率檢測
　　選取干擾效率最好的shRNA MSTN714構(gòu)建可控表達(dá)載體ptTS-MSTN shRNA，重組載體轉(zhuǎn)染小鼠成肌細(xì)胞經(jīng)G418篩選富集整合有外源載體的細(xì)胞，通過強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)細(xì)胞中MSTN shRNA表達(dá)，利用細(xì)胞免疫熒光觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白，利用QRT-PCR、Western blot技術(shù)檢測MS

5、TN mRNA及蛋白的表達(dá)水平檢測誘導(dǎo)效率。結(jié)果表明，tTS-MSTNshRNA組細(xì)胞和Control組細(xì)胞在不添加DOX時，僅檢測到少量綠色熒光表達(dá)，添加DOX后，GFP蛋白信號顯著增強(qiáng);經(jīng)DOX誘導(dǎo)后，轉(zhuǎn)染含MSTN shRNA重組載體細(xì)胞組MSTNmRNA相對表達(dá)水平比未經(jīng)DOX誘導(dǎo)組及其他對照組細(xì)胞中降低70％左右，差異極顯著(P＜0.01)，MSTN蛋白也下降90％左右，其他各組間MSTN mRNA及蛋白表達(dá)量差異不顯著(P＞

6、0.05)。
　　研究三:可控表達(dá)MSTN shRNA轉(zhuǎn)基因小鼠的制備及對小鼠生長發(fā)育的評價
　　將tTS-MSTN shRNA載體線性化后，利用顯微注射法制備MSTN shRNA可控表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠。利用PCR技術(shù)對獲得的F0代轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行整合檢測，利用QRT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)外源基因tTS的表達(dá)。檢測結(jié)果表明，制備的159只F0代小鼠中得到8只陽性小鼠。
　　選取tTS表達(dá)效率最好的轉(zhuǎn)基因小鼠擴(kuò)繁的后代

7、進(jìn)行轉(zhuǎn)基因小鼠MSTN shRNA誘導(dǎo)活性、生長狀況、繁殖性能、肌肉組織學(xué)等進(jìn)行檢測評價。結(jié)果表明，經(jīng)DOX誘導(dǎo)的Tg+DOX組小鼠體重顯著低于Tg、 WT+DOX、WT組小鼠;所制備的轉(zhuǎn)基因小鼠，DOX誘導(dǎo)前的產(chǎn)仔數(shù)（7±0.63&7.2±0.84）和窩存活仔數(shù)（6.2±0.75&6.4±0.55）均與同期飼養(yǎng)的正常小鼠(WT)差異不顯著(P＞0.05);與未經(jīng)誘導(dǎo)的MSTN轉(zhuǎn)基因小鼠及正常小鼠相比，加DOX誘導(dǎo)之后的MSTN轉(zhuǎn)基因小