SKF 83959對海馬神經(jīng)元鈣離子信號通路的影響及其神經(jīng)保護(hù)作用.pdf

1、一種新型的D1多巴胺受體通過耦聯(lián)于Gq蛋白激活PLCβ/IP3信號級聯(lián)反應(yīng)而促進(jìn)PI的水解被稱為PI-耦聯(lián)的新型多巴胺受體于最近被發(fā)現(xiàn)并廣為報(bào)道。SKF83959作為PI-D1多巴胺受體的特異性激動劑，與經(jīng)典的多巴胺受體激動劑不同的是它對cAMP/PKA信號途徑并不產(chǎn)生影響，我們以往的實(shí)驗(yàn)研究表明SKF83959在Ca2+存在的條件下可以影響腦片CaMKII，Cdk5的表達(dá)，但其具體的作用機(jī)制尚未完全闡明，對其與神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子及相關(guān)

2、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的尚未研究，且SKF83959對相關(guān)神經(jīng)退行性疾病的藥效學(xué)研究也進(jìn)行的很少。 本文擬在海馬神經(jīng)元上研究SKF83959對海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+及其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，并對其在Aβ25-35所致的海馬神經(jīng)元損傷作用中是否具有保護(hù)作用進(jìn)行探討，進(jìn)一步闡明SKF83959的作用機(jī)制，并為其在神經(jīng)退行性疾病中的應(yīng)用前景提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分SKF83959對培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣信號通路的影響

3、 §1SKF83959對原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元[Ca2+]i的影響 以Fura-2/AM為熒光探針，細(xì)胞內(nèi)熒光鈣成像的方法檢測SKF83959對培養(yǎng)海馬神經(jīng)元[Ca2+]i的影響。 0.1-30μmol/LSKF83959濃度依賴性地增加海馬神經(jīng)元[Ca2+]i，給予1μmol/LSKF83959后，2.0min即可引起[Ca2+]i的增加，5±2.1min使[Ca2+]i升高達(dá)最大值，其平均升高幅度約為96.0％±5.6

4、％(P＜0.05vscontrol)。 §2SKF83959引起海馬神經(jīng)元[Ca2+]i升高中Ca2+來源的研究 通過改變細(xì)胞內(nèi)外液中Ca2+含量，并利用不同的離子通道拮抗劑，觀察其對SKF83959升高培養(yǎng)海馬神經(jīng)元[Ca2+]i的影響。 給予1μmol/Lthapsigargin耗竭細(xì)胞內(nèi)鈣庫后，1μmol/LSKF83959不再引起[Ca2+]i變化。給予無Ca2+細(xì)胞外液時(shí)，1μmol/LSKF83959

5、仍能引起[Ca2+]i增加，但升高幅度明顯低于有鈣細(xì)胞外液中的反應(yīng)(52.0％±4.1％，P＜0.05vs1μmol/LSKF83959)，重新加入Ca2+到細(xì)胞外液后，[Ca2+]i進(jìn)一步升高。而預(yù)先給予10μmol/Lnifedipine和CdCl2(L-型鈣通道拮抗劑)，[Ca2+]i僅分別升高48.0％±3.0％和40.0％±5.0％(P＜0.01vs1μmol/LSKF83959)，50μmol/LAPV(NMDA受體拮抗劑)

6、和10μmol/LCNQX(AMPA受體拮抗劑)可部分拮抗[Ca2+]i的增加，僅分別升高[Ca2+]i45.0％±4.8％和68.0％±7.0％(P＜0.05vs1μmol/LSKF83959)，而2μmol/LTTX則不影響SKF83959升高[Ca2+]i的反應(yīng)。 §3SKF83959升高培養(yǎng)海馬神經(jīng)元[Ca2+]i作用機(jī)制的探討 應(yīng)用不同第二信使拮抗劑，探討1μmol/LSKF83959升高原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元[C

7、a2+]i的作用機(jī)制。 預(yù)先給予不同第二信使拮抗劑之后再給予1μmol/LSKF83959時(shí)，100nmol/LSKF83566(D1多巴胺受體拮抗劑)完全拮抗[Ca2+]i的增加(P＜0.05vs1μmol/LSKF83959inACSF)，S(-)-raclopride(D2多巴胺受體拮抗劑)則幾乎不產(chǎn)生任何影響，U-73122(PLCβ受體拮抗劑)和ATP(IP3受體拮抗劑)也表現(xiàn)出完全的拮抗效應(yīng)(P＜0.05vs1μmo

8、l/LSKF83959)，U-73343(U-73122無活性同構(gòu)物)和bucladesine(cAMP擬似激動劑)則不對SKF83959升高[Ca2+]i的反應(yīng)產(chǎn)生影響。而mesulergineHCl(5-HT1A受體拮抗劑)，prazosin(α1-腎上腺素受體拮抗劑)和scopolamine(m-Ach受體拮抗劑)也未能阻止1μmol/LSKF83959所引起的[Ca2+]i升高。 第二部分SKF83959預(yù)處理對Aβ25

9、-35致海馬神經(jīng)元損傷的作用及機(jī)制研究 §1SKF83959預(yù)處理對Aβ25-35致海馬神經(jīng)元細(xì)胞毒性的作用研究 培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞，設(shè)置空白對照組(正常培養(yǎng)海馬神經(jīng)元)，模型組(25μmol/LAβ25-35)，藥物預(yù)處理組(SKF83959預(yù)處理組)和陽性藥物L(fēng)iCl對照組，分別檢測海馬神經(jīng)元凋亡率。 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SKF83959和陽性藥物L(fēng)iCl預(yù)處理6h后均顯著降低老化的25μmol/LAβ25

10、-35造成的海馬神經(jīng)元損傷，增加海馬神經(jīng)元存活率，對其細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH含量檢測結(jié)果也與MTT趨向一致。 AnnexinV/PI匹配染色流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)SKF83959預(yù)處理組和陽性對照藥LiCl處理組均能降低25μmol/LAβ25-35造成的神經(jīng)元凋亡(P＜0.05vs25μmol/LAβ25-35)。Hoechst33342熒光染色法計(jì)數(shù)原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元凋亡率，與對照組相比，發(fā)現(xiàn)Aβ25-35明顯增加海

11、馬神經(jīng)元的凋亡率(32.1％±3.4％vs3.9％±0.7％，P＜0.01)，而20μmol/LSKF83959和10mmol/LLiCl預(yù)處理6h后可明顯減少Aβ25-35所致神經(jīng)元凋亡細(xì)胞數(shù)目的增加，分別降低至13.0％±0.9％和8.8％±0.7％(P＜0.05vs25μmol/LAβ25-35)。 §2Westernblot檢測培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)p-GSK3β9ser的表達(dá) Westernblot免疫印跡法檢測

12、各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞p-GSK3β9ser蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)25μmol/LAβ25-35能顯著降低p-GSK3β9ser的水平，而SKF83959和LiCl預(yù)處理6h后與模型組相比明顯增加p-GSK3β9ser的磷酸化水平，提示SKF83959可能通過增加p-GSK3β9ser的活性而發(fā)揮保護(hù)作用。 小結(jié) SKF83959通過激活PI-D1多巴胺受體而激活PLCβ/IP3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引發(fā)海馬神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣庫中Ca2+釋放

13、而增加[Ca2+]i，細(xì)胞內(nèi)增加的鈣離子可能通過激活第二信使如PKC等而磷酸化L-型電壓門控通道及NMDA受體門控通道，促進(jìn)其開放而介導(dǎo)細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流維持[Ca2]i進(jìn)一步升高。 在老化的25μmol/LAβ25-35作用24h建立的海馬神經(jīng)元損傷模型中，SKF83959和LiCl預(yù)處理6h均可顯著減少Aβ25-35所造成的損傷，初步研究結(jié)果表明SKF83959可能通過增加p-GSK3β9ser磷酸化，抑制GSK3β的活性而發(fā)