TMT對原代海馬神經元損傷與BDNF保護作用研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　三氯甲基錫(Trimethyltin,TMT)是一種重要的職業(yè)危害毒物,也是一種重要的環(huán)境污染物。急性TMT暴露可引起多系統(tǒng)主要包括神經系統(tǒng)的損害。TMT作用于中樞神經系統(tǒng),主要損傷作用機制為引起神經細胞凋亡,引起神經系統(tǒng)炎性反應,對神經組織造成氧化損傷等。TMT可以選擇性地誘導大腦邊緣系統(tǒng),特別是海馬神經元死亡,造成神經系統(tǒng)損傷效應。研究表明,BDNF在中樞神經系統(tǒng)的主要作用是調節(jié)海馬神經突觸可塑性。TMT

2、暴露的大鼠大腦BDNF表達下調,而過表達BDNF的神經元具有拮抗TMT神經毒性的作用。但TMT對大腦神經元的損傷機制特別是對神經元樹突棘的損傷研究還不清楚,并且BDNF拮抗TMT損傷發(fā)揮神經保護作用的機制尚待進一步研究。因此,本課題選取TMT及BDNF為研究內容,試圖理解TMT對神經元的損傷作用機制及BDNF保護作用的分子機制,并為治療和預防TMT職業(yè)暴露造成的神經元損傷提供思路。
　　突觸可塑性指突觸效率的功能性增強或降低,同時

3、神經信號傳遞強度的變化伴隨著神經元突觸的結構變化。并且,BDNF參與調節(jié)活動依賴的樹突棘發(fā)育及可塑性。近期研究表明BDNF可以作為成年腦中活動依賴性調節(jié)因子參與調控神經結構和功能變化。BDNF從樹突分泌出來后,立即與神經營養(yǎng)因子受體TrkB結合,進而促進突觸前神經遞質的釋放并且增加突觸后蛋白的轉錄翻譯水平。Tau蛋白主要表達于神經元樹突軸,獨立或與其他微管相關蛋白協(xié)同調節(jié)樹突軸微管功能。在神經細胞中,tau蛋白與細胞膜相聯(lián)系或與微管發(fā)生

4、相互作用。Tau蛋白表達或者結構的變化可能影響其穩(wěn)定微管蛋白的功能。在生理條件下,tau蛋白可能在不同的位點發(fā)生磷酸化改變,進而影響其穩(wěn)定微管的功能。成熟神經元可以利用微管的動態(tài)性保持細胞體系的彈性,以適應神經網絡發(fā)生的各種變化。
　　方法:
　　第一部分 TMT對神經元毒性的觀察
　　以原代培養(yǎng)的胚胎期18天海馬神經元為模型,用TMT處理后,用CCK-8的方法觀測BDNF對TMT的保護作用,觀察TMT處理后神經元樹突

5、棘形態(tài)的影響以及BDNF的保護作用,并明確TMT對神經元樹突棘毒性的特征;
　　第二部分 BDNF對神經元突觸和樹突棘生長影響的觀察
　　以原代培養(yǎng)的胚胎期18天海馬神經元為模型,用 BDNF處理,觀察對原代培養(yǎng)海馬神經元突觸生長和樹突棘形態(tài)的影響;利用質粒轉染 GFP或 RFP標記原代海馬神經元樹突棘,細胞免疫熒光化學觀測 tau蛋白和微管的共定位情況,突觸綜合體測量BDNF處理后突觸生長的變化,westernblot檢測

6、tau蛋白及其磷酸化變化,明確BDNF處理海馬神經元后,神經元的形態(tài)突觸可塑性的變化以及tau蛋白所起的作用;
　　第三部分 BDNF對Tau蛋白磷酸化及細胞分布的觀察
　　以RA分化的人神經母細胞瘤SH-SY5Y和原代培養(yǎng)的胚胎期18天海馬神經元為模型,用BDNF處理后,采用細胞免疫熒光化學的方法觀察tau蛋白的亞細胞分布情況,Leica軟件測量SH-SY5Y細胞的突觸生長情況,westernblot檢測tau蛋白表達變化

7、,明確tau蛋白亞細胞分布和BDNF處理后細胞的突觸生長的關系;
　　結果:
　　第一部分 TMT引起樹突棘的異常形態(tài)改變
　　TMT處理體外培養(yǎng)14天的原代海馬神經元24h,CCK-8檢測細胞活力顯著下降;加入BDNF與TMT共刺激后,CCK-8檢測細胞活力無顯著上升。原代海馬神經元體外培養(yǎng)7天時轉染GFP質粒,培養(yǎng)至20天,TMT和/或BDNF處理24h后固定細胞,共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)TMT處理后神經元樹突棘出現(xiàn)異常圓

8、形增大。加入BDNF處理后,樹突棘的異常圓形增大有減少的趨勢。BDNF與LiCl共刺激能夠同樣使神經元樹突棘出現(xiàn)與 TMT處理后高度相似的異常圓形增大。Westerbnlot實驗結果表明,BDNF處理后可以同時在原代培養(yǎng)的海馬神經元磷酸化 Akt和 ERK。而鋰單獨似乎不能影響Akt和ERK的磷酸化狀態(tài)。當鋰與BDNF同時作用時,BDNF誘導的ERK的磷酸化沒有影響,但鋰卻抑制BDNF誘導的Akt磷酸化。TMT以及BDNF和LiCl聯(lián)合

9、作用產生的神經元樹突棘異常增大可能與ERK與PI3K-Akt之間的cross-talk平衡被破壞有關。
　　第二部分 BDNF通過tau蛋白調節(jié)突觸和樹突棘生長
　　BDNF處理體外培養(yǎng)14天的海馬神經元24h, Tau蛋白的表達都顯著升高,Ser262位點的磷酸化狀態(tài)在BDNF刺激后具有下降的趨勢。細胞免疫熒光化學實驗也證明tau蛋白與微管蛋白在BDNF處理后的共定位得以增強。BDNF處理后tau蛋白的表達變化與樹突棘密度

10、的增加一致。運用shRNA技術在體外培養(yǎng)7天時下調tau蛋白表達水平后,培養(yǎng)至21天海馬神經元樹突棘密度顯著下降。并且在shRNA下調tau蛋白的海馬神經元中,24h BDNF刺激不能增加神經元的樹突棘密度。
　　第三部分 BDNF調節(jié)tau蛋白的磷酸化與亞細胞分布
　　通過免疫細胞化學方法,我們發(fā)現(xiàn)在未分化的缺乏神經突起的SH-SY5Y細胞中, tau蛋白形成一個球體。相反,在維甲酸誘導分化5天的 SH-SY5Y細胞中,t

11、au蛋白分散分布在神經細胞突起和胞體中。通過Western blot檢測方法,我們發(fā)現(xiàn)維甲酸的處理也增加了總tau蛋白水平而降低tau蛋白Ser262磷酸化水平。Tau蛋白表達上調和tau蛋白ser262磷酸化水平的下調與神經細胞突起長度呈相關性(相關因子分別為r=0.94和r=-0.98)。當原E18海馬神經元用微管解聚劑nocodazole處理后,新生的神經元突起丟失并且發(fā)生tau蛋白轉移到胞體的現(xiàn)象。這種遠離突起的過程可以被BDN

12、F一定程度上逆轉。
　　研究結論
　　基于以上研究結果,我們得出以下研究結論:TMT處理體外培養(yǎng)的海馬神經元后發(fā)現(xiàn)神經元的樹突棘出現(xiàn)異常的增大現(xiàn)象,可能是 TMT的神經毒性表現(xiàn)。BDNF具有保護TMT樹突棘損傷的潛力。TMT處理以及BDNF和LiCl聯(lián)合作用產生的神經元樹突棘異常增大可能與ERK與Akt之間的cross-talk平衡被破壞有關。BDNF能夠調節(jié)原代海馬神經元tau蛋白的表達,這樣的調節(jié)具有劑量依賴關系和時效依

13、賴關系。通過質粒轉染原代培養(yǎng)海馬神經元,下調 tau蛋白表達,BDNF刺激神經元樹突棘生長的現(xiàn)象被抑制,說明tau蛋白可能參與了BDNF調節(jié)神經元突觸及樹突棘生長的信號通路。進一步實驗表明,BDNF調節(jié)樹突棘可塑性的作用可能是通過調節(jié) tau蛋白的表達量進而影響tau蛋白穩(wěn)定微管能力來實現(xiàn)的;tau蛋白Ser262位點的磷酸化水平,總tau蛋白的表達量以及tau蛋白的亞細胞分布變化與神經細胞突觸生長的顯著相關, tau蛋白的表達增加以及