低分子量肝素對(duì)實(shí)驗(yàn)性小鼠結(jié)腸炎的治療作用及機(jī)理初探.pdf

1、第一部分急性結(jié)腸炎慢性化小鼠模型的建立 背景：潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩病(CD)是影響人類消化系統(tǒng)主要的慢性炎癥性腸病(IBD)。其病因?qū)W不明，但是近年來(lái)，對(duì)人尤其是炎癥性腸病相關(guān)的動(dòng)物模型的流行病學(xué)及遺傳學(xué)研究表明：遺傳易感性因素及由腸道環(huán)境中微生物因素驅(qū)動(dòng)的免疫反應(yīng)相互作用導(dǎo)致炎性疾病的發(fā)生及其慢性化過(guò)程。幾種動(dòng)物模型已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)去研究炎癥性腸病的病因，但是都不理想。當(dāng)選擇適當(dāng)，這些模型可用于研究炎性疾病的病理生理機(jī)制

2、，同時(shí)它們?cè)谂R床前期測(cè)試新的治療策略中也具有一定的價(jià)值。因?yàn)檠装Y反應(yīng)起病快，而且病程簡(jiǎn)單，所以用化學(xué)試劑誘導(dǎo)的腸道炎癥模型屬于最常見(jiàn)的炎癥性腸病模型。盡管這些模型像其他模型一樣有缺陷，但是它們?cè)谝恍┲匾拿庖呒敖M織病理學(xué)方面與人類炎癥性腸病的表現(xiàn)相似。用化學(xué)試劑葡聚糖硫酸鈉(DSS)能誘導(dǎo)出腸道炎癥。改變DSS的濃度和作用時(shí)間可建立適當(dāng)?shù)慕Y(jié)腸炎模型，對(duì)于進(jìn)一步研究其病因和發(fā)病機(jī)制具有重要意義。 目的：建立急性結(jié)腸炎慢性化的小鼠模

3、型，并探討其病理學(xué)特征。 方法：48只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為模型組(n=24)和正常對(duì)照組(n=24)。模型組自由飲用3％DSS溶液，5d后改飲用蒸餾水3周。正常對(duì)照組飲用蒸餾水26d。每日行疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分。于實(shí)驗(yàn)第5、12、19、26d分別處死6只小鼠，行結(jié)腸大體形態(tài)觀察、組織病理學(xué)評(píng)分和炎癥評(píng)分。 結(jié)果：造模第5d，模型組小鼠均出現(xiàn)腹瀉、便血、體質(zhì)量減輕等癥狀，光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)結(jié)腸多灶性淺潰瘍，上皮缺

4、失或少許殘留，隱窩破壞，杯狀細(xì)胞減少，以中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)黏膜和黏膜下層。改飲用蒸餾水3周后，小鼠體質(zhì)量恢復(fù)，腹瀉減輕，血便等癥狀消失，但鏡下仍見(jiàn)灶性小潰瘍，伴上皮不規(guī)則再生和數(shù)量較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。急、慢性期腸道病變均以遠(yuǎn)段結(jié)腸為重。 結(jié)論：?jiǎn)蝹€(gè)循環(huán)飲用3％DSS可誘導(dǎo)C57BL/6小鼠建立與人類臨床和病理表現(xiàn)相似的急、慢性結(jié)腸炎模型，為進(jìn)一步研究結(jié)腸炎提供了新的模型系統(tǒng)。 第二部分低分子量肝素對(duì)實(shí)驗(yàn)性小鼠結(jié)

5、腸炎的治療作用及機(jī)理初探 背景：肝素具有抗凝及抗炎的雙重作用，但是其在動(dòng)物模型及人類疾病中的抗炎機(jī)制仍不明確。 在炎癥性腸道疾病中，粘膜缺損后重建的正常愈合過(guò)程可能被炎癥所阻斷。這可能是由于生長(zhǎng)因子丟失或細(xì)胞黏附分子丟失，或者兩者同時(shí)丟失而降低了愈合的幾率。肝素治療能促進(jìn)潰瘍性結(jié)腸炎的愈合。Day等報(bào)道syndecan-1作為最主要的上皮syndecan，通過(guò)作為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF-2)的復(fù)合受體起作用，有助于

6、愈合[5]。在炎癥性腸病患者中，發(fā)現(xiàn)其修復(fù)上皮中的syndecan-1免疫染色顯著減少。體外實(shí)驗(yàn)表明，胃腸道上皮細(xì)胞硫酸乙酰肝素經(jīng)酶去除后，對(duì)FGF-2的增殖反應(yīng)降低。肝素能使syndecan-1對(duì)FGF-2反應(yīng)完全修復(fù)。 炎癥性腸病另一個(gè)特點(diǎn)是腸道通透性改變和大量的中性粒細(xì)胞從上皮細(xì)胞滲出。上皮細(xì)胞表達(dá)許多細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體，而趨化因子比如白細(xì)胞三烯B4，血小板活化因子及N-甲酰肽能加速中性粒細(xì)胞的跨膜遷移。Furuta等

7、證實(shí)在缺氧情況下誘導(dǎo)的粘膜損傷中，細(xì)胞因子與上皮表面及活化多形核白細(xì)胞(PMN)相關(guān)。他們發(fā)現(xiàn)上皮缺氧誘導(dǎo)了上皮表面白細(xì)胞介素8(IL-8)及HSPG基底膜蛋白多糖的表達(dá)，以及其它的細(xì)胞表面的HSPGs表達(dá)。而缺氧誘導(dǎo)的IL-8表達(dá)在肝素酶Ⅲ治療后顯著下降。源于肝素及硫酸乙酰肝素的雙糖能調(diào)節(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞分泌促炎癥反應(yīng)介質(zhì)。由此推測(cè)在炎癥性腸病中出現(xiàn)的syndecan-1表達(dá)變化經(jīng)細(xì)胞因子活化修飾后導(dǎo)致中性粒細(xì)胞黏附及滲出。 目

8、的：通過(guò)觀察低分子量肝素對(duì)DSS誘發(fā)的小鼠結(jié)腸炎結(jié)腸粘膜中自細(xì)胞介素IL-1β、IL-10、Sydecan-1mRNA以及Sydecan-1蛋白表達(dá)的影響，在一定程度上闡明肝素抗炎的分子機(jī)制。 方法： 1、54只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為模型組(n=18)、治療組(n=18)和正常對(duì)照組(n=18)。模型組和治療組自由飲用3％DSS溶液，5d后改飲用蒸餾水3周。正常對(duì)照組飲用蒸餾水26d。治療組每天1次皮下注射低分子量肝

9、素(克賽)5μg/小鼠，共20天；模型組及正常對(duì)照組每天1次皮下注射等量的生理鹽水。 2、每日行疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分。于實(shí)驗(yàn)第5、12、19、26d分別處死6只小鼠，行結(jié)腸大體形態(tài)觀察、組織病理學(xué)評(píng)分和炎癥評(píng)分。 3、用RT-PCR檢測(cè)小鼠結(jié)腸粘膜中IL-1β、IL-10及Sydecan-1mRNA的表達(dá)。 取適量的小鼠結(jié)腸組織，加入1mlTrizol后冰上勻漿，室溫靜置5分鐘，加入0.2ml氯仿，震蕩。室

10、溫靜置5分鐘后，12000g4℃離心15分鐘，將上清液移至新的離心管中，加入與上清等體積的異丙醇，震蕩，室溫靜置10分鐘，12000g4℃離心10分鐘，棄上清液。向沉淀中加入1ml75％乙醇清沈沉淀，12000g4℃離心5分鐘，棄上清保留沉淀，室溫下使之干燥。加入DEPC處理水10μl～20μl溶解RNA。用分光光度計(jì)檢測(cè)OD260/OD280吸光度比值，計(jì)算RNA濃度。取等量的治療組、模型組及正常對(duì)照組總RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。取

11、適量PCR產(chǎn)物與5×loadingbuffer混和后在1.5％瓊脂糖，80v電壓下進(jìn)行電泳。 4、用免疫組化方法檢測(cè)小鼠結(jié)腸粘膜中Sydecan-1蛋白的表達(dá)。 石蠟切片脫蠟至水后，將石蠟切片高壓抗原修復(fù)，滴加3％H2O2，室溫孵育10分鐘，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。滴加一抗工作液，室溫孵育2小時(shí)。滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃孵育30分鐘。DAB顯色，自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，脫水，透明，封片。 結(jié)果：

12、 1、與對(duì)照組相比，模型組及治療組中炎癥評(píng)分顯著升高，而治療組炎癥評(píng)分較模型組低，兩組間行兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，第20d時(shí)差異顯著(t=2.712，P=0.022)。與對(duì)照組相比，組織學(xué)評(píng)分在模型組及治療組中顯著升高，不同時(shí)間點(diǎn)兩組間分別行兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，治療組評(píng)分經(jīng)肝素治療后在各時(shí)間點(diǎn)較較模型組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，5d、12d、20dt值分別為2.390、2.907、3.101，P值分別為0.038、0.016、0.011。

13、 2、與對(duì)照組相比，IL-1β、IL-10mRNA表達(dá)在模型組及治療組中顯著升高，而治療組IL-1β、IL-10mRNA表達(dá)經(jīng)肝素治療后較模型組明顯下降，且存在治療因素與時(shí)間因素之間的交互效應(yīng)(F值分別為54.796、19.601，P值均為0.000)，不同時(shí)間點(diǎn)兩組間分別行兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-1βmRNA表達(dá)的t檢驗(yàn)在5d、12d、20dt值分別為2.522、20.511、25.175，P值分別為：0.

14、030、0.000、0.000；IL-10mRNA表達(dá)的t檢驗(yàn)在5d，12d，20dt值分別為2.964、14.532、10.730，P值分別為：0.014、0.000、0.000。 3、與對(duì)照組相比，模型組及治療組Sydecan-1mRNA及蛋白表達(dá)在5d均降低(P=0.000)；但是治療組Sydecan-1mRNA及蛋白表達(dá)在12、20d較模型組高，且存在治療因素與時(shí)間因素之間的交互效應(yīng)(F值分別為7.782、5.313，P

15、值分別為0.000、0.001)，不同時(shí)間點(diǎn)三組間分別行單向方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Sydecan-1mRNA表達(dá)作單向方差分析比較，F(xiàn)值在5d、12d、20dt值分別為36.046、46.343、13.259，P值均為0.000；Sydecan-1蛋白表達(dá)作單向方差分析比較，F(xiàn)值在5d、12d、20d分別為16.270、38.074、16.462，P值均為0.000。 結(jié)論：在DSS誘發(fā)的小鼠急性結(jié)腸炎慢性化過(guò)程中，低分子