轉(zhuǎn)hTNF-α基因在魚腥藻7120中表達(dá)產(chǎn)物的提取及其純化.pdf

1、藍(lán)藻屬光合自養(yǎng)生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，成本低廉，只需光、CO2、無機(jī)鹽和合適的溫度就能生長(zhǎng)，適于大規(guī)模生產(chǎn)。用藍(lán)藻為表達(dá)宿主制備hTNF-α口服保健品，可以避免大腸桿菌產(chǎn)生內(nèi)毒素、表達(dá)產(chǎn)物生成包涵體等弊端，能降低下游生產(chǎn)成本。 人腫瘤壞死因子-α(humantumornecrosisfactorα,hTNF-α)對(duì)腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞有特異的殺傷作用，是迄今為止唯一能夠直接殺死腫瘤細(xì)胞的天然因子，可能成為極有前景的抗癌藥。 本

2、文用5L瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)hTNF-α基因的魚腥藻7120(Anabaenasp.PCC7120)，進(jìn)行藻體破碎及一系列處理分離和純化hTNF-α，得到了從轉(zhuǎn)基因魚腥藻中獲得一定純度hTNF-α的優(yōu)化條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.用裝有4LBG-11培養(yǎng)液的5L大瓶，培養(yǎng)轉(zhuǎn)hTNF-α基因的魚腥藻7120(Anabaenasp.PCC7120)，90μmol/m2.s-1光照下培養(yǎng)，其24d時(shí)表達(dá)量最高，是收集藻細(xì)胞的最佳時(shí)期。 2.

3、通過提取緩沖液及藍(lán)藻細(xì)胞破碎方法的篩選，得出hTNF-α的最佳溶出條件為：0.05mol/L的pH7.5Tris-HCl緩沖液，NaCl0.2mol/L，EDTA0.01mol/L；超聲波法破碎最佳條件：超聲功率為800W，間歇時(shí)間為1s，工作時(shí)間為0.5s，濕藻與破碎液的質(zhì)量體積比為1:15，總超聲時(shí)間為8min，超聲一次；凍融處理的最佳條件：體積最好＜1.5mL，先在-20℃凍存過夜(12h)，融化后離心取上清，然后再在藻體中加入同

4、樣體積的破碎緩沖液-20℃凍2h，融化后離心取上清，兩次上清合并。 3.用溫度和鹽析對(duì)粗提液進(jìn)行初步純化，確定出最佳的處理溫度為：55℃處理30min；最佳的鹽析條件為：蛋白濃度為1.2～1.8mg/mL，最好接近1.8mg/mL，溫度為4～18℃，硫酸銨分級(jí)沉淀范圍為：30﹪～60﹪，pH為6.5；最佳的初步純化工藝為：將蛋白粗提液先用30﹪飽和度的硫酸銨處理1h后，然后直接用溫度55℃處理30min，12,000r/min離

5、心30min，將上清再用60﹪飽和度的硫酸銨處理1h，12,000r/min離心30min收集沉淀hTNF-α，用上柱緩沖液溶解。其hTNF-α回收率能達(dá)到86.83﹪，并可將約91.2﹪的雜蛋白去除，純度達(dá)到4.54﹪，純化倍數(shù)為9.880。 4.離子交換層析：比較了幾種離子交換填充柱材料的純化效果；最后選擇用DEAE-SephadexA50，然后又對(duì)洗脫液的最佳洗脫NaCl梯度和方式作了篩選。選擇出最佳的NaCl洗脫方式為階