hTNF-α抗體的制備及人鼠嵌合型基因工程抗體的研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種主要表現(xiàn)為軟骨和骨損傷的慢性自身免疫性疾病，全球發(fā)病率高達(dá)0.24％，嚴(yán)重威脅人類的健康。雖然RA的發(fā)病機(jī)制還不是完全清楚，但是研究者發(fā)現(xiàn)遺傳、環(huán)境、免疫調(diào)節(jié)異常等因素與它有關(guān)。其中，免疫調(diào)節(jié)異常與RA的關(guān)系廣受關(guān)注。引發(fā)和維持介質(zhì)與調(diào)停介質(zhì)的不平衡是引起免疫調(diào)節(jié)異常的重要原因，這將導(dǎo)致炎癥不受機(jī)體控制，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞損傷。在RA個(gè)體中，這種損傷表現(xiàn)為滑膜、軟骨、骨的破

2、壞。腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)的分泌異常是導(dǎo)致兩種介質(zhì)處于不平衡狀態(tài)、引起免疫調(diào)節(jié)異常并引發(fā)RA的重要因素之一，因此受到研究者的廣泛關(guān)注。
　　TNF-α是一種來(lái)源廣泛的、具有高度保守性的細(xì)胞因子，通過刺激多種細(xì)胞來(lái)發(fā)揮不同的功能。TNF-α抑制劑能夠特異性結(jié)合TNF-α，阻斷其生物活性，進(jìn)而控制炎癥、緩解病情，已在臨床上廣泛應(yīng)用。比如英夫利昔單抗、阿達(dá)木單抗和依那西普等，

3、但是，由于上述單抗成本高、價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜和免疫排斥等因素限制了它們的應(yīng)用。因此，需要開發(fā)一種成本較低、操作簡(jiǎn)單和免疫耐受的TNF-α抑制劑。
　　為了開發(fā)一種TNF-α抑制劑，本課題通過以人源TNF-α為抗原免疫Balb/c小鼠，制備抗TNF-α的鼠源單克隆抗體。為降低機(jī)體對(duì)該抗體的免疫排斥，對(duì)該抗體進(jìn)行人源化改造，最終獲得一株嵌合型抗體，為后續(xù)開發(fā)有效的TNF-α抑制劑打下基礎(chǔ)。
　　首先，用hTNF-α免疫雌性Bal

4、b/c小鼠，通過單克隆抗體技術(shù)獲得了八株分泌特異性結(jié)合hTNF-α的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)染色體結(jié)構(gòu)及數(shù)量的驗(yàn)證，均符合雜交瘤細(xì)胞的特征。對(duì)單抗亞型鑒定的結(jié)果顯示，制備的單抗是IgMκ亞型。挑選其中三株用于制備腹水，用特異性結(jié)合免疫球蛋白κ輕鏈的Protein L對(duì)腹水進(jìn)行純化。通過BCA法測(cè)得純化后的抗體濃度為2 mg/ml。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示純化后的單抗純度較高，Western blot檢測(cè)結(jié)果驗(yàn)證了單克隆抗體為IgM

5、亞型。為了挑選一株合適的雜交瘤細(xì)胞株用于后續(xù)的基因工程改造，對(duì)純化后的三株單抗進(jìn)行了親和力的測(cè)定，通過非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定單克隆抗體親和力，最終計(jì)算得到2B9E10單抗的Ka=1.6×108 M-1、3E4C11單抗的Ka=7.698×108M-1、4H5A10單抗的Ka=5.9×107M-1，細(xì)胞株2B9E10和3E4C11細(xì)胞株所分泌的抗體屬于高親和力抗體。故挑選親和力最高的3E4C11單抗進(jìn)行基因工程改造。
　　其次，用通

6、用引物調(diào)取3E4C11細(xì)胞株的輕、重鏈可變區(qū)基因，經(jīng)過SOE PCR將可變區(qū)基因以交聯(lián)臂(Gly4Ser)3連接，構(gòu)成單鏈抗體(ScFv)，將其與人源IgG1Fc段基因序列相連，構(gòu)建到真核表達(dá)載體中。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，最終Western blot結(jié)果顯示在胞漿中檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá)。
　　通過本課題的研究，我們不僅自主研制出了特異性結(jié)合hTNF-α的鼠源性單克隆抗體，并對(duì)其進(jìn)行基因工程改造，獲得嵌合型抗體