魚腥藻PCC7120鐵調(diào)蛋白基因all1691的初步研究.pdf

1、藍(lán)藻（Cyanophyceae）或藍(lán)細(xì)菌分布廣泛，種類繁多，形態(tài)多樣，電鏡下可見光合色素匯集的類囊體，因此藍(lán)藻是一種光合自養(yǎng)型原核微生物，在食用、資源開發(fā)、環(huán)境凈化等方面都有較高的應(yīng)用價(jià)值。魚腥藻 PCC7120異形胞的發(fā)育調(diào)控及固氮機(jī)制的研究基本完善，本文研究對(duì)象鐵攝取調(diào)節(jié)蛋白FurA受控于異形胞發(fā)育調(diào)控因子NtcA，各部件緊密聯(lián)系于精細(xì)網(wǎng)絡(luò)中保證藻細(xì)胞正常的活性。
　　本研究第一部分是在前期研究基礎(chǔ)上，選取魚腥藻 Anabae

2、na sp. PCC7120為實(shí)驗(yàn)材料，以藻內(nèi)鐵攝取調(diào)節(jié)基因fur（ferric uptake regulator）作為研究對(duì)象，旨在對(duì)魚腥藻 PCC7120中鐵攝取調(diào)節(jié)基因 furA(all1691)及其相關(guān)基因進(jìn)行克隆和表達(dá)，并探究環(huán)境中Fe3+濃度對(duì)藻生長(zhǎng)情況的影響。首先對(duì)傳統(tǒng)的酚氯仿法進(jìn)行改進(jìn)，提取魚腥藻PCC7120染色體總DNA，由Cynobase提供的序列信息設(shè)計(jì)特異性引物，以魚腥藻PCC7120總DNA為模板進(jìn)行Touc

3、h-down PCR，擴(kuò)增furA、furB、furC這3個(gè)fur同源基因片段，運(yùn)用TA克隆獲得穩(wěn)定保存的pMD-fur菌液，經(jīng)質(zhì)粒提取及雙酶切，將目的片段與表達(dá)載體pET-28a進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌E.coli BL21中構(gòu)建furA重組表達(dá)質(zhì)粒載體pET-1691，在1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)下，于37℃下?lián)u床培養(yǎng)15 h，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)到含表達(dá)載體系統(tǒng)自帶標(biāo)簽（T7和組氨酸標(biāo)簽）的約19 KD的蛋白條帶，為了得到實(shí)

4、驗(yàn)條件下蛋白表達(dá)的最優(yōu)表達(dá)量，前期已對(duì)誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度等影響因素進(jìn)行探究實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在37℃、0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)量最佳。本實(shí)驗(yàn)對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)12 h是誘導(dǎo)時(shí)間設(shè)置中的最佳誘導(dǎo)時(shí)間。為了預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)與功能，輔助生物信息學(xué)的方法，利用在線軟件對(duì)FurA進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，它屬于定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)，與細(xì)胞壁結(jié)合的蛋白，構(gòu)建的三維圖顯示邊緣具有約5個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)域，包裹中間區(qū)域的β折疊結(jié)構(gòu)區(qū)。進(jìn)一步對(duì)蛋白進(jìn)行純化，用于后續(xù)

5、研究。
　　本研究第二大部分設(shè)計(jì)不同F(xiàn)e3+濃度，系統(tǒng)化的研究藻細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中藻細(xì)胞密度、蛋白含量、葉綠素含量和總糖含量這些生長(zhǎng)指標(biāo)的變化，以探究對(duì)魚腥藻PCC7120的生長(zhǎng)影響。結(jié)合分光光度法、標(biāo)準(zhǔn)曲線法和分子生物方法，從生長(zhǎng)曲線看出，低鐵濃度組（0-0.6 mg/L）生長(zhǎng)速率隨著鐵濃度增大而增大，尤其到達(dá)0.6 mg/L，增長(zhǎng)斜率最大，為藻細(xì)胞的最適生長(zhǎng)濃度；中間鐵濃度組（0.6-0.9 mg/L），當(dāng)濃度達(dá)0.9 mg/L

6、時(shí)，生長(zhǎng)情況下滑，表現(xiàn)為葉綠素濃度、總蛋白、糖類含量的總體下降，尤其是高鐵濃度組（1.4-4 mg/L）時(shí)，藻類不堪高濃度鐵負(fù)荷，生長(zhǎng)每況愈下。缺鐵組的RNA條帶亮度最弱，F(xiàn)e3+濃度為2.0 mg/L時(shí)藻細(xì)胞密度最大，RNA濃度最高，條帶最亮。這些變化與預(yù)期結(jié)果基本一致，即低濃度鐵促進(jìn)藻生長(zhǎng)，反之抑制。
　　鑒于淡水藻類研究甚少，前期實(shí)驗(yàn)已實(shí)現(xiàn)了FurC的表達(dá)，本文選擇鐵調(diào)控路徑中發(fā)揮主要作用的FurA為主要研究對(duì)象，結(jié)合生物信