以PLGA和Pluronic-F127為支架構建組織工程骨軟骨復合組織的實驗研究.pdf

1、一、研究背景及現(xiàn)狀: 關節(jié)軟骨全層損傷往往并發(fā)軟骨下骨硬化或囊性變等損傷，骨壞死后期因關節(jié)面塌陷可致關節(jié)軟骨結構破壞，因此長骨干骺端病損無論原發(fā)于關節(jié)軟骨或骨，到后期均表現(xiàn)為骨軟骨同時破壞，目前對這種軟骨合并軟骨下骨損傷的治療困難，效果欠佳<'[1,2,3]>。尤其關節(jié)軟骨再生能力極其有限，一旦損傷，病損關節(jié)往往不可遏止地逐步惡化，最終導致骨關節(jié)炎(o s t e o a r t h r i t i s，O A)。僅修復軟骨而不

2、處理病變的軟骨下骨也難以得到滿意的效果。各種原因所致的關節(jié)壞死、關節(jié)缺損、關節(jié)強直、關節(jié)攣縮等是導致患者導致關節(jié)功能障礙，傷殘，引起關節(jié)永久性的結構和功能損失的重要原因，這種情況在負重的髖、膝等大關節(jié)尤其常見。 隨著材料學、細胞生物學、工程學以及相關物理、化學學科的發(fā)展，一種新的組織缺損的修復方法——組織工程(tissue engineering)逐漸被提出并應用。組織工程是一門應用工程學和生命科學的原理和方法，來研究正?；虿±?/p>

3、狀況下哺乳動物組織的結構、功能和生長機制，研究開發(fā)能夠修復、維持或改善損傷組織的人工生物替代物的新興綜合性交叉學科。其最基本的思路是采集功能相關的活細胞，種植于天然或人工合成的、具有一定空間結構的三維支架上，在體外培養(yǎng)，使細胞大量增殖，然后將其移植人體內，達到形成具有一定結構和功能的組織和器官的目的。細胞培養(yǎng)支架的選擇是組織工程學研究的焦點之一。支架材料作為人工細胞外基質，為功能細胞的停泊、生長、繁殖、新陳代謝提供三維空間。隨著材料的降

4、解吸收，細胞所分泌的基質長人，逐漸形成新的組織，在這一發(fā)育過程中，逐漸替代病變的組織或改善其功能<'[4]>。其三大要素是：種子細胞、支架材料及工程組織和器官的發(fā)生，其中支架材料具有不可替代的主要作用，且與材料科學的發(fā)展有著密不可分的關系。組織工程的出現(xiàn)為解決組織缺損的問題提供了新思路．使組織缺損的完全再生成為可能<'[4]>。 人體的器官由多種不同的組織成分構成，關節(jié)頭由骨及其表面的透明軟骨構成，具有特殊的解剖結構和生理特點，

5、用人工材料難以完全替代，再造生物性關節(jié)頭正是組織工程技術最有前景的領域之一。目前組織工程技術用來再造細胞成分單一的組織，如軟骨、骨等，己獲得廣泛的成功<'[5,6]>。但對于由多種細胞成分構成的復雜組織的再造，研究報道還較少。 單純組織工程軟骨修復關節(jié)骨軟骨復合缺損時，移植體與移植床的愈合的界面是軟骨～軟骨界面的整合；若合并軟骨下骨缺損，則尚有軟骨～骨界面的整合。其修復過程中上述兩種界面的整合較慢，移植體在移植床存在植入早期的不

6、穩(wěn)定等潛在的不穩(wěn)定因素，可能導致修復失敗因素。骨組織之間的整合比骨和軟骨間整合快而且更加牢固．本實驗構建組織工程骨與軟骨復合物，旨在修復軟骨下骨缺損同時，使移植體在缺損區(qū)的整合固定界面由軟骨～骨變?yōu)楣恰墙缑?，從而加快界面的愈?'[7,8]>。 采用帶骨軟骨移植修復負重面軟骨缺損具有以下優(yōu)點：(1)軟骨下的骨栓與受體部位的骨床可以緊密嵌合，獲得初期的穩(wěn)定性，這為以后的生物學愈合修復過程奠定了基礎；(2)軟骨下骨是松質骨，它與受

7、體骨槽的結合部位有豐富的血供，從而為移植體的存活創(chuàng)造了條件；(3)軟骨下骨與受體骨槽完成骨的一期愈合過程，沒有多少骨痂形成，松質骨骨小梁逐漸連通，成骨細胞爬入，骨縫消失，為移植軟骨的負重功能提供良好的基礎；(4)透明軟骨之間的間隙可以通過軟骨細胞爬入，纖維細胞的化生等過程進行修復，從而彌合間隙，完成最終的修復過程，獲得一個局部光滑平整、可以承重的透明軟骨面<'[9,10]>。 采用組織工程學方法構建骨軟骨復合組織的時間并不長，近

8、5年來逐步從外培養(yǎng)發(fā)展到體內植入，研究過程中發(fā)現(xiàn)了一些新問題。例如，李旭升<'[11]>等將骨髓基質細胞(B M S C s)成誘導軟骨后接種于快速成形的三維支架材料聚乳酸/聚羥乙酸共聚物(P L G A)構建組織工程軟骨，經(jīng)成骨誘導的B M S C s接種于聚乳酸/聚羥乙酸共聚物/磷酸三鈣(P L G A/T C P)構建組織工程骨，在體外分別培養(yǎng)2周后，將兩種工程化組織及兩者以無損傷線縫合形成的組織工程骨軟復合體分別植入自體股部肌袋

9、，術后8周取材，行組織學觀察。結果術后組織學觀察表明，組織工程軟骨在體內可形成軟骨組織，組織工程骨在體內可形成骨組織，兩者的復合體在體內可形成骨軟骨復合物。Gao<'[12]>等將大鼠干細胞誘導成軟骨細胞后接種于透明質酸海綿，誘導成成骨細胞后接種于多孔磷酸鈣陶瓷，然后用纖維蛋白陶瓷將兩者粘結在一起，于裸鼠皮下進行培養(yǎng)，結果顯示構建出了骨軟骨復合組織。 但是以上方法均存在構建組織的骨軟骨界面結合不佳的問題。而關節(jié)骨和軟骨的界面結合

10、強度不足將難以滿足關節(jié)載荷的要求。目前骨軟骨復合組織構建研究在促進軟骨與軟骨下骨界面形成方面還有待于進一步完善。有文章報道<'[13]>，骨軟骨界面結合不佳是由于不同支架材料本身的物理特性(如支架的熱膨脹系數(shù)，彈性性能等)。Chang<'[14]>等將組織工程軟骨凝膠支架交聯(lián)于三維的多孔磷酸鈣表面，然后接種軟骨細胞于凝膠支架，將復合物進行體外培養(yǎng)，4周后結果顯示構建的組織工程軟骨長入了多孔支架的內部，二者的界面結合良好，這一實驗證明了組

11、織工程凝膠材料可以滲透入三維多孔支架的內部。但是Chang的實驗只是在空白成骨支架上構建出組織工程軟骨組織，并不是真正意義上的組織工程骨軟骨復合組織。本實驗就是希望在構建出組織工程骨軟骨復合組織的同時，較好地解決組織工程骨軟骨界面結合欠佳的問題。 二、研究目的: 1．探討PIuronic-F127和PLGA作為組織工程支架聯(lián)合應用于構建組織工程骨軟骨組織的可行性。 2．解決組織工程骨軟骨界面結合欠佳的問題。

12、 三、研究方法: 1．兔關節(jié)軟骨細胞及成骨細胞的培養(yǎng)：分別取兔關節(jié)軟骨及脛骨骨膜，用酶消化法原代培養(yǎng)得到軟骨細胞及成骨細胞，并分別對培養(yǎng)的軟骨細胞及成骨細胞進行Ⅱ型膠原免疫組化染色和堿性磷酸酶染色鑒定。繼而大量擴增細胞。 2．組織工程骨軟骨的構建及裸鼠體內培養(yǎng)： ①支架的預處理：將PLGA支架材料加工成厚10mm×6mm×4mm大小，用無水乙醇及三蒸水充分浸泡清洗使支架濕化。使用前泡入培養(yǎng)液中過夜預濕，并以多聚

13、賴氨酸包被，增強細胞對支架的貼附力，將PLGA支架隨機分為兩組，分別作為實驗組和對照組1，每組各5枚。 ②組織工程骨的體外構建：取生長狀態(tài)良好的第4代成骨細胞，用培養(yǎng)液配制成密度為5×10<'7>/m l的細胞懸液，緩慢滴加到干燥后的實驗組PLGA表面，置于37℃，體積分數(shù)為5﹪CO<,2>孵箱，靜止培養(yǎng)4h后再加入條件培養(yǎng)基于細胞培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)2d，使細胞在材料表面完全貼附。 ③組織工程軟骨的體外構建：以PBS配制3

14、0﹪濃度的Pluronic-F127，在4℃液態(tài)狀態(tài)下將生長狀態(tài)良好的第3代軟骨細胞與其混勻，制成細胞凝膠復合物，使軟骨細胞終濃度為5×10<'7>/mL。 ④組織工程骨軟骨的體外構建及體內培養(yǎng)：2d后取出培養(yǎng)的實驗組成骨細胞-PLGA，在其表面涂布薄層的負載軟骨細胞的Pluronic-F127水凝膠，厚約1mm。單純空白PLGA支架和單純空白Pluronic-F127凝膠分別作為對照組1和對照組2。體重為20g左右裸鼠，共5只

15、，麻醉后無菌條件下于背部正中做長約1.5cm切口，鈍性分離皮下層，各組材料植入裸鼠背部皮下組織中，每只裸鼠均植入3塊材料，切口兩側分別作為實驗組側和對照組側，切口左側植入組織工程骨軟骨復合物，切口右側植入對照組1和對照組2。術后用絲線縫合切口，75﹪酒精消毒切口。標記后將動物放入無菌飼養(yǎng)包內分籠飼養(yǎng)。 3．取材并觀察標本：于2個月后處死動物取材，大體標本觀察，并常規(guī)脫鈣，脫水，石蠟包埋后切片，行HE染色．光鏡下觀察骨組織及軟骨組

16、織形成情況，Ⅱ型膠原免疫組化觀察軟骨細胞Ⅱ型膠原表達能力。 四、結果: 1．大體觀察：術后2個月實驗組成功構建出組織工程骨軟骨組織，在PLGA的上半部分形成的組織為白色，表面較光滑，有彈性，為軟骨組織；下半部分為暗紅色，質地較堅硬，為骨組織，再造出的兩種組織間有清晰的界限。骨組織與軟骨組織結合牢固。 2．組織學觀察：①組織工程骨觀察：PLGA支架中可見有可觀察到明顯的成骨現(xiàn)象，新形成的骨組織連接成片塊狀或條索狀。

17、②組織工程軟骨觀察：軟骨組織中細胞多，形態(tài)基本正常，分布較均勻。軟骨細胞增殖成株狀或島狀，可見同源軟骨細胞簇，多位于軟骨陷窩內，基質較豐富。③二者結合界面觀察：二者結合界面結合良好，在部分界面區(qū)域可見軟骨組織與骨組織相互長入。 3．軟骨組織Ⅱ型膠原免疫組化結果陽性，表明構建軟骨分泌Ⅱ型膠原為主。 五、結論: Pluronic-F127和PLGA分別作為軟骨細胞和成骨細胞的組織工程支架，采用向成骨細胞-支架復合物涂