CPC-PLGA復(fù)合材料體外構(gòu)建組織工程化骨的實(shí)驗研究.pdf

1、支架材料和種子細(xì)胞一直是組織工程學(xué)研究的重點(diǎn)，作為骨組織工程基礎(chǔ)的支架材料，需要滿足多方面的苛刻要求，現(xiàn)有的支架材料各有缺點(diǎn)，均不理想。通過改進(jìn)制造工藝，將不同材料復(fù)合，有望開發(fā)出性能優(yōu)良的新型支架材料。骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有取材方便、增殖能力強(qiáng)、可向成骨細(xì)胞分化等多項優(yōu)點(diǎn)，是骨組織工程種子細(xì)胞的熱門之選。 目的本實(shí)驗通過混合磷酸鈣骨水泥(CPC)和聚乳酸一聚乙醇酸共聚體(PLGA)兩種生物材料，加工制備出一種新型

2、的支架材料CPC—PLGA復(fù)合物。然后以人的MSCs為種子細(xì)胞體外初步構(gòu)建出組織工程化骨，為進(jìn)一步的動物體內(nèi)實(shí)驗提供依據(jù)。 方法此次實(shí)驗主要分為材料制備理化性能檢測、細(xì)胞培養(yǎng)鑒定成骨誘導(dǎo)、組織工程化骨種植構(gòu)建三個步驟。 材料制備及理化性能檢測：低溫粉碎PLGA(50：50)，篩選出100～300μm的PLGA微粒，然后按比例與CPC混合均勻，滴加固化液(磷酸鹽緩沖液)后填入模具，擠壓固化成型。制成后，利用試驗機(jī)檢測復(fù)合材

3、料的力學(xué)性能，利用X射線衍射儀(XRD)分析固化產(chǎn)物的組成，利用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察材料表面的降解情況。 細(xì)胞培養(yǎng)鑒定成骨誘導(dǎo)：征集并篩選健康志愿者，髂前上嵴穿刺抽取骨髓，分離后培養(yǎng)、擴(kuò)增，溴化3一(4，5一二甲基噻唑一2)一2，5一二苯基四氮唑(MTT)比色法繪制細(xì)胞生長曲線，流式細(xì)胞分析儀(FCM)鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)，混合化學(xué)誘導(dǎo)劑(B一甘油磷酸鈉、抗壞血酸、地塞米松)誘導(dǎo)細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化4周，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀

4、察，鈣一鈷法堿性磷酸酶(AKP)染色，定量檢測試劑盒檢測AKP酶的活性改變和ABC免疫組化試劑盒檢測I型膠原、骨鈣素(OC)表達(dá)，采用Von Kossa’s染色法進(jìn)行鈣化結(jié)節(jié)染色。 組織工程化骨種植構(gòu)建：制作成片狀的CPC—PLGA復(fù)合材料，消毒處理后，表面種植對數(shù)生長期MSCs，培養(yǎng)7天后掃描電鏡觀察。 結(jié)果力學(xué)儀檢測CPC—PLGA復(fù)合材料的抗壓強(qiáng)度達(dá)到40.5 MPa，彈性模量達(dá)到13.8Gpa；XRD分析CPC—

5、PLGA復(fù)合材料與單一的CPC的固化產(chǎn)物主要物相均為羥基磷灰石(HA)；SEM觀察發(fā)現(xiàn)CPC—PLGA復(fù)合材料表面僅有微孔；模擬體液(Ringer’s液)浸泡降解6周后材料表面出現(xiàn)大小約為100～300um孔洞，分布均勻。 MTT比色法檢測細(xì)胞1周生長情況，繪制生長曲線推算細(xì)胞倍增時間約為30小時；FCM檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物CD29陽性，CD34、CD45為陰性；使用化學(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)4周，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化為多邊形，有毛刺，生長

6、趨于停滯；AKP染色陽性；AKP／ALP活性定量檢測約為誘導(dǎo)前4倍，統(tǒng)計學(xué)分析P<0.05，差別有統(tǒng)計學(xué)意義；免疫組化染色發(fā)現(xiàn)I型膠原、oC表達(dá)陽性；鈣化結(jié)節(jié)染色發(fā)現(xiàn)有鈣化結(jié)節(jié)形成。 種植后電鏡觀察細(xì)胞在支架材料表面粘附生長，材料表面開始降解。 結(jié)論CPC-PLGA復(fù)合材料制作方法簡易、可塑性強(qiáng)、理化性能優(yōu)良、降解性好，是較為理想的骨組織工程支架材料。將hMSCs種植于CPC-PLGA復(fù)合材料上，體外環(huán)境下可初步構(gòu)建組織