快速成形制備的PLGA支架-膠原凝膠復(fù)合體構(gòu)建組織工程軟骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、各種原因造成的軟骨缺損是臨床上常見(jiàn)的問(wèn)題，由于軟骨的組織學(xué)和生物學(xué)特性限制了其自身的修復(fù)能力，目前尚缺乏有效的治療措施。組織工程技術(shù)的發(fā)展為軟骨缺損的修復(fù)提供了新的手段，利用具有特定空間結(jié)構(gòu)的支架材料引導(dǎo)軟骨細(xì)胞的增殖和基質(zhì)分泌，最終形成類(lèi)似正常軟骨組織的結(jié)構(gòu)，并行使功能。
　　近年來(lái)軟骨組織工程支架的研究側(cè)重于對(duì)材料表面的設(shè)計(jì)以提高材料的生物性能。支架表面特性對(duì)細(xì)胞/支架復(fù)合起重要作用。目前有很多方法，如堿處理、等離子放電和表面

2、改性等都可提高材料表面的生物相容性。
　　在支架材料的研究中，復(fù)合材料是目前研究的熱點(diǎn),即將兩種或兩種以上具有互補(bǔ)理化性質(zhì)的生物相容性可降解材料,按一定比例和方式組合,可設(shè)計(jì)出結(jié)構(gòu)與性能優(yōu)化的三維支架材料。以彌補(bǔ)單用人工合成或天然生物材料的缺陷。
　　本研究的目的是構(gòu)建具有理想空間結(jié)構(gòu)的復(fù)合支架材料，即運(yùn)用快速成形技術(shù)制備的PLGA支架材料結(jié)合膠原凝膠，探討其作為組織工程支架材料的可行性。
　　本研究包括以下幾部分內(nèi)容

3、：
　　1.制備具有生物活性的PLGA支架材料：
　　將聚酯PLGA（LA/GA=50/50）充分溶解于1,4-二氧六環(huán)有機(jī)溶劑形成無(wú)色透明液體。采用清華大學(xué)激光快速成形中心開(kāi)發(fā)研制的低溫?cái)D出成形設(shè)備-生物材料快速成形機(jī)TissFormTM，經(jīng)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)(CAD)結(jié)合低溫?cái)D出成形工藝，在低溫成形室中固化堆積，得到冷凍的三維材料。低溫快速成型的方法所制備的載體框架的孔隙結(jié)構(gòu)、孔隙率、力學(xué)性能符合軟骨組織工程載體框架的要求，

4、可以作為軟骨組織工程的支架材料。
　　2.兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)及生物活性檢測(cè)：
　　運(yùn)用酶消化的方法獲得軟骨細(xì)胞，并觀察原代及傳代培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。用甲苯胺藍(lán)及免疫組化的方法鑒定軟骨細(xì)胞。成功建立體外培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法。原代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞呈多角形,傳代3次后出現(xiàn)去分化。形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)染色顯示細(xì)胞培養(yǎng)3代以內(nèi)可以保持表型的穩(wěn)定。本文建立的體外培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的方法簡(jiǎn)單可行。體外培養(yǎng)的第2代兔軟骨細(xì)胞表型穩(wěn)

5、定,細(xì)胞增殖活力良好,適用于實(shí)驗(yàn)研究。
　　3.PLGA及膠原改性材料與軟骨細(xì)胞相容性的觀察：
　　通過(guò)對(duì)原始及改性材料與軟骨細(xì)胞相容性的觀察，檢測(cè)支架材料的生物活性。包括親水性的測(cè)定，細(xì)胞計(jì)數(shù)，掃描電鏡。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，改性后材料親水性及細(xì)胞黏附率較改性前支架均有顯著性提高。
　　4.膠原凝膠包埋軟骨細(xì)胞復(fù)合快速成形PLGA支架的接種方法：
　　通過(guò)將膠原凝膠包埋的軟骨細(xì)胞接種到快速成形的PLGA材料上并進(jìn)行體外培養(yǎng)

6、觀察，細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞粘附情況，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞在支架內(nèi)分布的均一性。結(jié)果顯示，90％以上的細(xì)胞能夠有效、均勻接種于支架材料上，所以，膠原凝膠包埋軟骨細(xì)胞三維接種能有效提高種子細(xì)胞的接種效率，防止細(xì)胞流失。
　　5.裸鼠體內(nèi)成軟骨實(shí)驗(yàn)：
　　通過(guò)將膠原凝膠包埋的軟骨細(xì)胞接種到快速成形PLGA材料的復(fù)合物植入裸鼠體內(nèi)于不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行大體觀察，組織學(xué)染色檢查軟骨形成情況。大體觀察，有類(lèi)軟骨樣組織形成，所形成的組織形態(tài)保持良好，

7、具有一定的厚度，未見(jiàn)收縮。組織學(xué)結(jié)果顯示軟骨細(xì)胞在體內(nèi)生長(zhǎng)增殖良好,隨時(shí)間延長(zhǎng)材料逐漸降解軟骨組織逐漸成熟。
　　本實(shí)驗(yàn)證明低溫快速成形技術(shù)制備的PLGA支架經(jīng)膠原改性后具有良好的親水性、降解性和生物相容性。凝膠包埋細(xì)胞接種支架材料的方法能夠均勻、高效的將細(xì)胞固定于多孔材料中，提高細(xì)胞接種效率。同時(shí)，凝膠包埋的軟骨細(xì)胞接種到快速成形的PLGA材料的復(fù)合物具有良好的成軟骨能力。所以，膠原凝膠包埋快速成型PLGA支架材料可作為載體復(fù)合