電壓門控鉀通道和線粒體膜上ATP敏感鉀通道在人體缺氧性肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖中的作用及調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景:目前，肺動(dòng)脈高壓和肺心病的發(fā)病率仍然居高不下。缺氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxicpulmonaryhypertension，HPH)是最常見(jiàn)的類型，其發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚，缺氧性肺血管收縮(hypoxicpulmonaryarteryvasoconstriction，HPV)和缺氧性肺血管重建(hypoxicpulmonaryvascularremodeling)是其兩大病理生理基礎(chǔ)。目前認(rèn)為，缺氧引起的肺血管收縮并非完全依

2、賴于血管內(nèi)皮細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞也可介導(dǎo)血管收縮反應(yīng)。在影響血管張力的各種因素中，血管平滑肌細(xì)胞鉀通道發(fā)揮著十分重要的作用。鉀通道可能與肺血管收縮和重建都有密切的聯(lián)系，因此，研究者將缺氧與鉀通道的關(guān)系作為研究熱點(diǎn)，但目前以人體肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞為研究對(duì)象的還比較少。 缺氧可抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞鉀通道的活性，引起肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)去極化，達(dá)到一定閾值后，電壓依賴性鈣通道開(kāi)放，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，作為重要的第二信使

3、，鈣離子促發(fā)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞收縮、增殖和遷移，也可激活各種蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)一步引起缺氧性肺血管收縮和肺血管重建，最終導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞已知有三種鉀通道，分別是延遲整流鉀通道(Kv)、鈣激活的鉀通道(Kca)和ATP敏感的鉀通道(KATP)。目前的研究表明，Kv在控制靜息膜電位及氧感受方面起著重要的作用。 在缺氧性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展中，缺氧介導(dǎo)肺血管舒縮障礙的各種體液因子以及介導(dǎo)肺血管重建的各種細(xì)胞增殖因子形

4、成了復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，這些網(wǎng)絡(luò)之間的調(diào)控機(jī)制是怎樣的，他們又是如何對(duì)鉀通道進(jìn)行調(diào)控的，對(duì)平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡又是怎樣調(diào)控的，關(guān)于這些的研究還不多，以人體肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞為研究對(duì)象的更少。線粒體膜上ATP敏感的鉀通道(MitoKATP)是影響線粒體膜電位(△ψm)的重要因素，目前它在心肌細(xì)胞缺氧和缺血預(yù)適應(yīng)中研究的比較多，在其它方面，尤其是肺疾病方面研究的甚少。MitoKATP同樣是對(duì)缺氧非常敏感，MitoKATP在有氧的情況下通常是關(guān)

5、閉的，此時(shí)△ψm處于垮塌狀態(tài)；反之MitoKATP被激活而開(kāi)放，△ψm去極化。線粒體、MitoKATP和Kv通道都是敏感的氧感受器，MitoKATP與Kv是否相互聯(lián)系呢?與PASMCs的增殖是否有聯(lián)系呢?另外PKC、鈣離子和Bcl-2等在其中又起什么作用呢?基于此，本研究從離子通道水平和基因表達(dá)水平，利用分子生物學(xué)、免疫組織化學(xué)技術(shù)、膜片鉗技術(shù)，激光共聚焦顯微技術(shù)等多種實(shí)驗(yàn)方法，探討Kv和MitoKATP在肺血管重建中的作用及其調(diào)控機(jī)制

6、，為HPH的發(fā)病機(jī)制研究和防治提供基礎(chǔ)資料。 第一部分線粒體膜上ATP敏感鉀通道在缺氧抑制人體肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜上電壓門控鉀通道中的作用 目的：線粒體膜上ATP敏感鉀通道(MitoKATP)在細(xì)胞缺氧信號(hào)傳導(dǎo)中的作用已經(jīng)開(kāi)始被重視，它是影響線粒體膜電位(△ψm)的重要因素，MitoKATP開(kāi)放引起△ψm去極化。本實(shí)驗(yàn)從MitoKATP入手，研究它在缺氧影響人體肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜電位及鉀通道Kv1.5基因表達(dá)中的作用，旨在

7、探索人類肺動(dòng)脈高壓、肺源性心臟病的發(fā)生機(jī)制，為找到新的防治方法的探索提供試驗(yàn)依據(jù)。 方法：(略） 結(jié)果：(略） 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺氧可以引起MitoKATP的開(kāi)放以及△ψm的去極化，并進(jìn)而抑制了Kv的功能，參與并影響了肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展。至于缺氧是怎樣引起MitoKATP開(kāi)放的以及MitoKATP的開(kāi)放又是如何影響Kv通道的，他們之間的信號(hào)傳導(dǎo)途徑還要在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。 第二部分PKC在

8、線粒體膜上ATP敏感鉀通道影響人體肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞膜電位和Kv1.5基因表達(dá)中的作用 目的：肺動(dòng)脈高壓和肺心病，目前其仍有較高的發(fā)病率。PKC信號(hào)傳導(dǎo)通路在肺動(dòng)脈高壓中發(fā)揮重要作用。Kv通道在調(diào)節(jié)細(xì)胞膜電位上是最重要的，它是目前肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制研究的一個(gè)熱點(diǎn)，但精確機(jī)制仍不清楚。Kv通道的表達(dá)和活性被許多因素調(diào)控，例如第二信使(cAMP,cGMP)和蛋白激酶。所有能影響Kv通道的因素都可引起血管收縮或舒張。近來(lái)，線粒體膜電位(

9、△ψm)在細(xì)胞缺氧信號(hào)傳導(dǎo)中的作用已經(jīng)開(kāi)始被重視，線粒體膜上ATP敏感鉀通道(MitoKATP)是影響△ψm的重要因素，MitoKATP開(kāi)放引起△ψm去極化。MitoKATP是否也參與了肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生呢?MitoKATP與Kv是否相互聯(lián)系呢?本試驗(yàn)以人體肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞為研究對(duì)象，利用分子生物學(xué)和膜片鉗技術(shù)，研究MitoKATP對(duì)人體PASMCs膜電位及Kv1.5表達(dá)的影響，及其PKC在其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的可能作用，旨在探索人類肺源性肺動(dòng)脈

10、高壓心臟病的發(fā)生機(jī)制，為找到新的防治方法的探索提供試驗(yàn)依據(jù)。 方法：(略） 結(jié)果：（略） 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MitoKATP的開(kāi)放可抑制Kv通道的活性和表達(dá)，可能參與并影響了肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展，其中PKC在其中可能起介導(dǎo)作用，Diazoxide與R0-31-8220同時(shí)應(yīng)用沒(méi)有使Kv電流和Kv1.5的表達(dá)恢復(fù)到正常對(duì)照組水平，說(shuō)明可能除了PKC以外還有其它的因素參與其中，有待進(jìn)一步研究。 第三部分

11、線粒體膜上ATP敏感鉀通道在缺氧性人體肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖中的作用 目的：缺氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxicpulmonaryhypertension，HPH)的發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚，缺氧性肺血管收縮(hypoxicpulmonaryarteryvasoconstriction，HPV)和缺氧性肺血管重建(hypoxicpulmonaryvascularremodeling)是其兩大病理生理基礎(chǔ)。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖在肺血管重

12、建中起十分重要的作用，但是其中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑還不清楚。線粒體膜上ATP敏感鉀通道(MitoKATP)對(duì)缺氧十分敏感，它是影響線粒體膜電位的重要因素。本實(shí)驗(yàn)從線粒體膜上ATP敏感的鉀通道(mitochondrialmembraneATP-sensitivepotassiumchannel,MitoKAATP)入手，研究線粒體膜電位在缺氧性肺血管重建中的作用。 方法：(略） 結(jié)果：（略） 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Mit

13、oKATP是缺氧引起肺血管重建通路中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，MitoKATP可能參與并影響了肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展，至于它和缺氧之間的相互關(guān)系及其信號(hào)傳導(dǎo)途徑還要在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。 第四部分Ca2+-MitoKATP通路在Kv通道的抑制介導(dǎo)人體肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖中的作用 目的：肺血管重建是肺動(dòng)脈高壓的一個(gè)主要的病理特征。肺血管重建主要表現(xiàn)為肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞過(guò)度增殖，可能是由于增殖的促進(jìn)和/或凋亡的抑制引起。但其中精確的

14、機(jī)制尚不清楚。目前，Kv通道在肺動(dòng)脈高壓發(fā)生機(jī)制中的作用成為研究熱點(diǎn)，Kv通道可能介導(dǎo)了PASMCs的增殖，但在人體肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞模型上研究很少。本研究是以人體PASMCs為研究對(duì)象，探討Kv通道與肺血管重建的可能聯(lián)系，以及探討線粒體膜上ATP敏感的鉀通道(MitoKATP)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子和Bcl-2等因素在Kv通道介導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖中的作用，旨在探索人類肺源性肺動(dòng)脈高壓心臟病的發(fā)生機(jī)制，為找到新的防治方法的探索提供試驗(yàn)依據(jù)。

15、 方法：分離出人正常肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(humanpulmonaryarterysmoothmusclecells，HPASMCs)，進(jìn)行常氧培養(yǎng)。分組情況：線粒體膜電位的檢測(cè)和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分為3組：①正常對(duì)照組；②4-AP(Kv通道特異性阻斷劑)組；③4-AP+EGTA(細(xì)胞外鈣離子鰲合劑)組；細(xì)胞增殖凋亡的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分為5組：①正常對(duì)照組；②4-AP組；③4-AP+Diazoxide組；④4-AP+5-HD組；⑤4-

16、AP+EGTA。利用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、原位缺口末端標(biāo)記(TUNEL)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、Fura-2熒光測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、免疫組化方法檢測(cè)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Bcl-2的蛋白表達(dá)等方法分析PASMCs增殖凋亡情況；線粒體膜電位的檢測(cè)采用Rhodamine-123fluorescence法。 結(jié)果：（略） 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Kv通道的抑制可以介導(dǎo)人體肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖；并且Kv通道的抑制還可以使M