自發(fā)性高血壓大鼠冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞電壓依賴(lài)性鉀離子通道的研究.pdf

1、目的：為什么要研究高血壓狀態(tài)下冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(CASMCs)離子通道?其目的在于：(1)CASMCs電生理特性尚不清楚，研究報(bào)道的文獻(xiàn)很少，尤其是關(guān)于高血壓狀態(tài)下CASMCs電生理改變的報(bào)告更少，其原因可能在于分離CASMCs有一定難度，特別是在高血壓心臟上分離CASMCs更難(研究后才發(fā)現(xiàn))；(2)高血壓狀態(tài)下阻力血管的管壁張力增加，心臟壓力負(fù)荷增大，心肌細(xì)胞代償性肥大，目前對(duì)機(jī)體如何維持冠狀動(dòng)脈舒張功能的機(jī)制尚不清楚，因此了解如

2、何保持阻力血管的血流，保障心肌供血的代償機(jī)制很有必要；(3)血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的電生理特征存在共性，但不同靶器官供血調(diào)節(jié)也存在個(gè)性，因此不能把電生理共性簡(jiǎn)單推導(dǎo)用于冠狀動(dòng)脈循環(huán)的調(diào)節(jié)。鑒于此，有必要立題研究正常血壓和高血壓狀態(tài)下CASMCs的電生理特性。
　　 方法：(1)本題選用自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)作為高血壓模型，因?yàn)槠浒l(fā)病過(guò)程接近臨床高血壓病的發(fā)病過(guò)程。分離大鼠冠狀動(dòng)脈后，采用三步酶消化法獲得CASMCs，并

3、經(jīng)過(guò)鼠源α-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體加以鑒定。
　　 (2)VSMCs的收縮依賴(lài)于鈣離子內(nèi)流，舒張依賴(lài)于鉀離子外流。目前已知VSMCs膜表面存在四種鉀離子通道，分別為鈣激活電壓依賴(lài)性鉀離子通道(KCa)、電壓依賴(lài)性鉀離子通道(KV)、內(nèi)向整流性鉀離子通道(Kir)以及ATP敏感性鉀離子通道(KATP)。對(duì)于CASMCs膜表面存在的大電導(dǎo)鈣激活電壓依賴(lài)性鉀離子通道(BKCa)本實(shí)驗(yàn)室先前也進(jìn)行過(guò)研究。本課題主要研究CASMCs膜表面KV

4、通道電流以及KV1.2和KV1.5通道亞型mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　 (3)獲得大鼠冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞后，應(yīng)用膜片鉗全細(xì)胞記錄模式分別記錄WKY大鼠和SHR大鼠CASMCs膜表面混合鉀電流(KV通道電流和少量BKCa通道電流)、KV通道電流、尾電流和靜息電位，并繪制各種電流的Ⅰ-Ⅴ曲線、穩(wěn)態(tài)激活曲線和穩(wěn)態(tài)失活曲線。分析兩組大鼠CASMCs上KV通道電流特點(diǎn)及通道動(dòng)力學(xué)特性。
　　 (4)提取WKY大鼠和SHR大鼠冠狀

5、動(dòng)脈的RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)(FQ-PCR)的方法比較兩組大鼠KV1.2和KV1.5通道亞型的mRNA水平。
　　 (5)提取WKY大鼠和SHR大鼠冠狀動(dòng)脈總蛋白，采用蛋白免疫印跡方法(WesternBlot)對(duì)兩組大鼠KV1.2和KV1.5通道亞型的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果：(1)正常血壓對(duì)照組WKY大鼠(n=79)平均體重為317±24.9克，尾動(dòng)脈平均收縮壓為118.44±3.75

6、 mmHg。高血壓組SHR大鼠(n=66)平均體重為281±21.4克，尾動(dòng)脈平均收縮壓為192.52±11.06 mmHg。血壓水平在兩組大鼠之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 (2)WKY大鼠CASMCs(n=30)的平均電容為17.48±2.59 pF，SHR大鼠CASMCs(n=25)的平均電容為15.44±2.68 pF，兩組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 (3)WKY和SHR大鼠CAS

7、MCs靜息電位平均值分別為-47.7±3.52 mV(n=11)和-34.5±1.69 mV(n=9)。靜息電位在兩組之間的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 (4)按照混合鉀電流刺激程序記錄到WKY大鼠(n=7)在測(cè)試電位為+60 mV、+50mV、+40 mV、+30 mV和+20 mV時(shí)的電流密度分別為20.21±1.38 pA/pF、15.82±0.91 pA/pF、12.95±0.94 pA/pF、10.15±

8、1.35 pA/pF和7.47±0.54 pA/pF，SHR大鼠(n=6)的電流密度分別為30.36±2.29 pA/pF、26.55±2.28 pA/pF、23.05±2.30 pA/pF、18.19±1.98 pA/pF和13.30±1.03 pA/pF。相同電壓下WKY大鼠混合鉀電流的平均電流密度小于SHR大鼠，兩組之間的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 (5)在外液內(nèi)加入BKCa通道特異性阻滯劑IBTX后，記錄

9、KV通道電流。得到WKY大鼠在測(cè)試電位為+60 mV、+50 mV、+40 mV和+30 mV時(shí)的電流密度分別為19.21±1.53 pA/pF、15.62±1.40 pA/pF、12.84±1.33 pA/pF和10.09±1.06 pA/pF，SHR大鼠的電流密度分別為28.56±1.93 pA/pF、24.70±1.31 pA/pF、19.90±1.16 pA/pF和15.79±1.09 pA/pF。相同電壓下WKY大鼠的KV通道

10、電流平均電流密度小于SHR大鼠，兩組之間的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 (6)WKY大鼠KV通道電流密度較自身混合鉀電流密度輕度減小，在測(cè)試電位為+60 mV、+50 mV、+40 mV和+30 mV時(shí)平均下降百分比分別為4.94％、1.25％、0.87％和0.55％，加用阻滯劑前后電流密度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SHR大鼠KV通道電流密度較自身混合鉀電流平均下降百分比分別為5.94％、6.97％、13

11、.67％和13.18％，兩者之間電流密度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 (7)按照尾電流刺激程序記錄到WKY大鼠(n=5)在條件電位為+60 mV、+50 mV、+40 mV、+30 mV和+20 mV時(shí)的尾電流密度分別為17.54±0.76 pA/pF、11.89±1.25pA/pF、9.85±0.55 pA/pF、7.54±0.42 pA/pF和5.20±0.95 pA/pF，而SHR大鼠(n=5)在相同的測(cè)試電

12、位下的尾電流密度分別為26.95±2.46 pA/pF、24.40±1.37 pA/pF、19.73±1.56 pA/pF、16.59±0.55 pA/pF和9.08±0.54 pA/pF。相同電壓下WKY大鼠的KV通道尾電流平均電流密度小于SHR大鼠，兩組之間的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 (8)WKY大鼠KV通道穩(wěn)態(tài)激活曲線的半數(shù)激活電壓V1/2=33.93±1.87 mV，SHR大鼠的半數(shù)激活電壓V1/2=2

13、0.68±1.02 mV。兩組之間的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。WKY大鼠KV通道穩(wěn)態(tài)激活曲線的斜率因子k=15.19±1.81 mV，SHR大鼠的斜率因子k=15.74±0.93 mV。兩組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 (9)WKY大鼠(n=7)KV通道穩(wěn)態(tài)失活曲線的半數(shù)失活電壓V1/2=-23.8±1.1 mV，SHR大鼠(n=5)半數(shù)失活電壓V1/2=-20.08±1.28 mV。兩組之間的差異無(wú)

14、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。WKY大鼠KV通道穩(wěn)態(tài)失活曲線的斜率因子k=14.72±1.01 mV，SHR大鼠斜率因子k=16.71±1.20 mV。兩組之間的差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 (10)將WKY大鼠目的基因2-△△Ct值設(shè)定為對(duì)照值1，F(xiàn)Q-PCR反應(yīng)顯示SHR大鼠KV1.2通道亞型mRNA的相對(duì)表達(dá)量是WKY大鼠的2.11±0.10倍。兩組之間具有顯著性差異(P<0.05)；SHR大鼠KV1.5通道亞

15、型mRNA的相對(duì)表達(dá)量是WKY大鼠的2.34±0.40倍。兩組之間的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 (11)經(jīng)過(guò)內(nèi)參GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化，Western Blot發(fā)現(xiàn)WKY和SHR大鼠KV1.2通道蛋白灰度比值分別為0.61±0.13和0.84±0.10；KV1.5通道蛋白灰度比值則分別為0.47±0.10和0.96±0.07。KV1.2和KV1.5通道蛋白在兩組之間的差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　

16、 結(jié)論：經(jīng)過(guò)研究表明，SHR大鼠CASMCs靜息膜電位明顯低于(負(fù)電位值減小)正常血壓WKY大鼠，由于平滑肌細(xì)胞膜電位降低能夠增加鈣離子內(nèi)流，使冠狀動(dòng)脈供血受損，因此標(biāo)志著SHR大鼠冠狀動(dòng)脈壁張力明顯高于WKY大鼠。但對(duì)SHR大鼠CASMCs復(fù)極電流的研究表明，混合鉀電流和KV通道電流都有所增大，明顯大于WKY大鼠相應(yīng)的復(fù)極電流。并且SHR大鼠KV1.2和KV1.5通道亞型mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)增加，與其電流改變的結(jié)果相一致，標(biāo)志SHR