NOR1在人肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖中的作用.pdf

1、肺動脈高壓（pulmonary artery hypertension, PAH）是慢性阻塞性肺?。╟hronic obstructive pulmonary disease, COPD）的主要并發(fā)癥之一，與COPD預(yù)后關(guān)系密切。PAH的發(fā)病機(jī)制包括持續(xù)性肺血管收縮、肺血管重構(gòu)以及血栓形成等。在肺血管重構(gòu)過程中肺動脈平滑肌細(xì)胞（pulmonary artery smooth muscle cells, PASMCs）的異常增殖發(fā)揮重要作

2、用。神經(jīng)元衍生的孤核受體1（neuron-derived orphan receptor1, NOR1）是核受體超家族的成員之一，它和Nur77，Nurrl組成了核受體家族的NR4A亞家族。NOR1屬于一類即刻早期基因（immediate early genes, IEG）編碼的蛋白，廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、炎癥、癌癥以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)的人PASMCs來研究NOR1在PASMCs增殖中的作用及其作用機(jī)制。

3、
　　第一部分 NOR1在人肺動脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）中的表達(dá)
　　目的：探討NOR1在人PASMCs中的表達(dá)及作用。
　　方法：1、體外培養(yǎng)人肺動脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs），將PASMCs分為兩組：對照組（Control組）：含0.5%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基（smooth muscle cell media，SMCM）培養(yǎng)組；血清組（FBS組）：含10%F

4、BS的SMCM培養(yǎng)組。2、分別采用MTT法、PCNA免疫組化染色法檢測各組PASMCs的增殖情況。3、分別采用Real time PCR和Western-blot法檢測各組細(xì)胞中NOR1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1、體外培養(yǎng)24小時(shí)后，F(xiàn)BS組PASMCs的增殖較Control組明顯增加，與Control組相比MTT檢測的OD值為0.446±0.0243 vs0.349±0.037（P<0.05）；PCNA免疫組化染色

5、陽性率為：0.509±0.044 vs0.261±0.035（P<0.05）。2、體外培養(yǎng)2小時(shí)后，Real time PCR與Western blot檢測發(fā)現(xiàn)FBS組PASMCs中NOR1表達(dá)量較Control組明顯增高：FBS組PASMCs中NOR1的mRNA表達(dá)量（Control的倍數(shù)）與Control組相比為：3.781±0.442 vs1（P<0.05）；FBS組PASMCs中NOR1的蛋白表達(dá)量（與內(nèi)參β-actin的比值）

6、與Control組相比分別為：0.573±0.137 vs0.112±0.013（P<0.05）。
　　結(jié)論：血清刺激后 PASMCs中 NOR1的 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加并伴隨有PASMCs的細(xì)胞增殖，提示NOR1可能參與PASMCs的增殖調(diào)控。
　　第二部分NOR1在人肺動脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）增殖中的分子機(jī)制
　　目的：研究NOR1調(diào)控人肺動脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）增殖的機(jī)制。
　　方法：1、

7、體外培養(yǎng)人PASMCs，采用轉(zhuǎn)染試劑PEI25K將NOR1的反義寡核苷酸轉(zhuǎn)入PASMCs。2、將PASMCs分為4組：①對照組（Control組）：含0.5%FBS的SMCM培養(yǎng)組；②血清組（FBS組）：含10%FBS的SMCM培養(yǎng)組；③血清+空轉(zhuǎn)染組（FBS+N組）：含10%FBS的SMCM培養(yǎng)的不含NOR1反義寡核苷酸的空轉(zhuǎn)染組；④對照+轉(zhuǎn)染組（FBS+AS組）：含10%FBS的SMCM培養(yǎng)的NOR1反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染組。3、采用MT

8、T法、PCNA免疫組化染色法檢測各組PASMCs的增殖情況。4、分別采用Real time PCR和Western-blot法檢測各組細(xì)胞中NOR1、CyclinD1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1、體外培養(yǎng)2小時(shí)后，NOR1反義寡核苷酸能夠有效抑制NOR1的表達(dá)。Real time PCR檢測NOR1 mRNA表達(dá)量（Control的倍數(shù)）結(jié)果：FBS+AS組與FBS組相比為：1.893±0.163 vs4.021±0.

9、386（P<0.05）；Western blot檢測NOR1的蛋白表達(dá)量（與內(nèi)參的比值）結(jié)果：FBS+AS組與FBS組相比為：0.430±0.039 vs0.870±0.071（P<0.05）。2、體外培養(yǎng)24小時(shí)后，NOR1反義寡核苷酸能夠明顯抑制人PASMCs的增殖。MTT檢測結(jié)果：FBS+AS組與 FBS組的 OD值相比為：0.385±0.046 vs0.441±0.039（P<0.05）；PCNA免疫組化染色陽性率檢測結(jié)果：FB

10、S+AS組與FBS組相比為：0.331±0.044 vs0.511±0.054（P<0.05）。3、體外培養(yǎng)6小時(shí)，NOR1反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染后PASMCs中CyclinD1的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯下降。Real time PCR檢測CyclinD1 mRNA表達(dá)量（control的倍數(shù)）結(jié)果：FBS+AS組與FBS組相比為：1.513±0.161 vs2.310±0.301（P<0.05）；Western blot檢測Cyclin