原發(fā)性腎病綜合征遺傳學基礎探討——NPHS2、WT1和PLCE1基因突變分析.pdf

1、第一部分中國南方漢族人家族性激素耐藥型腎病綜合征家系NPHS2基因突變分析
　　 目的：原發(fā)性腎病綜合征(primary nephrotic syndrome,PNS)是兒童時期最常見的腎小球疾病,根據(jù)患兒對糖皮質激素治療的療效,PNS被分成激素敏感型腎病綜合征(steroid-sensitive nephrotic syndrome,SSNS)和激素耐藥型腎病綜合征(steroid-resistant nephrotic sy

2、ndrome,SRNS)。為探討中國南方漢族人家族性SRNS家系NPHS2基因突變及其特點,我們對3個中國南方漢族人家族性SRNS家系進行了NPHS2基因突變分析。
　　 方法：研究對象為A、B、C 3個南方漢族人SRNS家系先證者及其姐姐和父母,50例尿檢正常的南方漢族健康成年人作為對照人群。取所有研究對象外周靜脈血3ml,10％枸櫞酸鈉抗凝,提取基因組DNA。應用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reacti

3、on,PCR)擴增NPHS2基因全部8個外顯子及其周圍的部分內含子和啟動子全長序列(大約2.6kb),對PCR產物直接進行DNA序列測定。
　　 結果：對3個南方漢族人SRNS家系先證者NPHS2基因全部8個外顯子及其周圍的部分內含子進行突變分析,未發(fā)現(xiàn)NPHS2基因致病突變,僅在外顯子8上檢測到1個NPHS2基因多態(tài)性(954T>C)。在3個家系的先證者及其姐姐和父母的NPHS2基因啟動子上檢測到6個變異:-1715A>G、-

4、1709G>A、-1000A>T、-670C>T、-116C>T和-51G>T。
　　 結論：本研究對3個中國南方漢族人常染色體隱性遺傳的SRNS家系先證者的NPHS2基因的全部8個外顯子及其周圍的部分內含子和啟動子全長進行了突變分析,未發(fā)現(xiàn)NPHS2基因致病突變,但在外顯子8發(fā)現(xiàn)了一個已報道的基因多態(tài)性,在啟動子新發(fā)現(xiàn)了1個變異和1個基因多態(tài)性以及4個已報道的基因多態(tài)性,提示NPHS2基因突變不是本研究3個SRNS家系的主要致

5、病因為。
　　 第二部分 中國漢族人家族性激素耐藥型腎病綜合征家系WT1基因突變分析
　　 目的：PNS是兒童時期最常見的腎小球疾病,其主要臨床特征為大量蛋白尿。大約10％～20％PNS患兒對激素治療耐藥,即SRNS,其中大部分患兒逐漸進展到ESRD。NPHS2是常染色體隱性遺傳型家族性SRNS的常見致病基因之一,但由于遺傳背景的差異,部分家族性SRNS非NPHS2基因突變所致。WT1是一種鋅指樣轉錄因子,研究表明它是足

6、細胞的兩個特異基因(NPHS1和NPHS2)的上游調節(jié)基因,在SRNS的發(fā)生過程中起著重要的調節(jié)作用。WT1基因突變可引起Denys-Drash綜合征等多種腎小球疾病。我們對3個中國漢族人家族性SRNS家系進行了WT1基因突變分析。
　　 方法：研究對象為A、B、C 3個中國南方漢族人SRNS家系的先證者及其姐和父母,50例尿檢正常的中國南方漢族健康成年人作為對照人群。取所有研究對象外周靜脈血3ml,10％枸櫞酸鈉抗凝,提取基因

7、組DNA。PCR方法擴增WT1基因全部10個外顯子及其周圍的部分內含子,PCR方法擴增WT1基因全部10個外顯子及其周圍的部分內含子,應用對PCR產物直接進行DNA序列測定法和PCR/限制性片段長度多態(tài)性分析法(PCR-RFLP)檢測WT1基因變異。
　　 結果：對3個中國漢族人SRNS家系的先證者WT1基因全部10個外顯子及其周圍的部分內含子進行突變分析,未發(fā)現(xiàn)WT1基因致病突變,但在3個SRNS家系的先證者WT1基因外顯子檢

8、測到2個變異-126C>T(P42P)和903A>G(R300R)。這2個變異在100條正常染色體中也有檢出,提示它們均為WT1基因多態(tài)性。在家系C的先證者WT1基因內含子區(qū)檢測到1個變異-IVS5-64A>G。這個變異在100條正常染色體中也有檢出,提示它亦為WT1基因多態(tài)性。126C>T、903A>G和IVS5-64A>G多態(tài)性在對照人群中的等位基因頻率分別為0.67、0.71和0.02。126C>T和903A>G多態(tài)性已見文獻報道

9、,IVS5-64A>G為新發(fā)現(xiàn)的WT1基因多態(tài)性。
　　 結論：本研究對3個中國漢族人常染色體隱性遺傳型SRNS家系先證者的WT1基因的全部10個外顯子及其周圍的部分內含子進行了突變分析,未發(fā)現(xiàn)WT1基因致病突變,但發(fā)現(xiàn)了2個已經報道的WT1基因多態(tài)性和1個新發(fā)現(xiàn)的WT1基因多態(tài)性,提示WT1基因突變不是本研究3個SRNS家系的主要致病因為。
　　 第三部分 中國漢族人家族性激素耐藥型腎病綜合征家系PLCE1基因突變分析

10、
　　 目的：PNS是兒童時期最常見的腎小球疾病,約10％～20％PNS患兒對激素治療耐藥(SRNS),其中大部分患兒逐漸進展到ESRD,需要腎替代治療如透析或腎移植生存。迄今,已經證實有8個不同的單基因突變能夠導致人類SRNS,它們分別為NPHS1、LAMβ2、CD2AP、ACTN4、TRPC6、NPHS2、WT1和PLCE1基因；其中NPHS1、LAMβ2、CD2AP、NPHS2、WT1和PLCE1基因突變可以引起常染色體隱

11、性遺傳型SRNS。鑒于國際上有發(fā)現(xiàn)PLCE1基因突變可引起家族性SRNS,發(fā)病年齡為0.2歲～8.8歲,而國內尚未見對SRNS兒童進行PLCE1基因突變分析的報道,為進一步分析我國漢族人家族性SRNS家系的致病基因及其特點,我們在對3個常染色體隱性遺傳的SRNS家系進行NPHS2和WT1基因突變分析之后,又對他們進行了PLCE1基因突變分析。
　　 方法：研究對象為A、B、C 3個南方漢族人SRNS家系先證者及其姐姐和父母,50

12、例尿檢正常的南方漢族健康成年人作為對照人群。取所有研究對象外周靜脈血3ml,10％枸櫞酸鈉抗凝,提取基因組DNA。PCR方法擴增PLCE1基因全部31個編碼外顯子及其周圍的部分內含子區(qū)。應用對PCR產物直接進行DNA序列測定法和PCR-RFLP方法檢測PLCE1基因變異。
　　 結果：對3個中國漢族人SRNS家系先證者在3個家系的先證者PLCE1基因的全部31個編碼外顯子及其周圍的部分內含子進行突變分析,未發(fā)現(xiàn)PLCE1基因致病

13、突變,但檢測到13個變異。
　　 結論：本研究對3個中國漢族人常染色體隱性遺傳型SRNS家系先證者PLCE1基因的全部編碼外顯子及其周圍的部分內含子進行了突變分析,未發(fā)現(xiàn)PLCE1基因致病突變,但發(fā)現(xiàn)了12個已報道的和1個新發(fā)現(xiàn)的PLCE1基因多態(tài)性,提示PLCE1基因突變也不是本研究3個漢族人SRNS家系的主要致病因子。
　　 第四部分 中國南方漢族人散發(fā)性激素耐藥型腎病綜合征兒童NPHS2基因突變分析
　　

14、目的：PNS是兒童時期最常見的腎小球疾病,臨床表現(xiàn)為大量蛋白尿、低蛋白血癥、高膽固醇血癥和不同程度的浮腫。80％～90％PNS患兒對激素治療敏感,預后良好；然而,10％～20％PNS患兒對激素治療耐藥,即SRNS。為分析我國南方漢族人散發(fā)性SRNS兒童NPHS2基因突變及其特點,我們對收集到的15例中國南方漢族人散發(fā)性SRNS兒童進行了NPHS2基因突變分析。
　　 方法：研究對象為15例南方漢族人散發(fā)性SRNS兒童,50例尿檢

15、正常的南方漢族健康成年人作為對照人群。取所有研究對象外周靜脈血3ml,10％枸櫞酸鈉抗凝,提取基因組DNA。
　　 結果：對15例南方漢族人散發(fā)性SRNS兒童NPHS2基因全部8個外顯子及其周圍的部分內含子進行突變分析,未發(fā)現(xiàn)NPHS2基因致病突變,但在其中13例SRNS兒童的NPHS2基因外顯子上檢測到兩個變異。
　　 結論：本研究對15例中國南方漢族人散發(fā)性SRNS患兒NPHS2基因的全部外顯子及其周圍的部分內含子進

16、行突變分析,未發(fā)現(xiàn)NPHS2基因致病突變,但檢測到2個已報道的NPHS2基因多態(tài)性,提示NPHS2基因突變不是本研究15例中國南方漢族人散發(fā)性SRNS兒童的主要致病因為。
　　 第五部分 激素依賴型腎病綜合征兒童NPHS2基因突變分析
　　 目的：為了進一步探討中國SDNS兒童NPHS2基因突變及其特點,我們對1例中國SDNS兒童進行了NPHS2基因突變分析。
　　 方法:研究對象為1例SDNS患兒及其父母、弟弟

17、,50例尿檢正常成年人。分別取所有研究對象的外周靜脈血各3ml,10％枸櫞酸鈉抗凝,提取基因組DNA。應用PCR方法擴增患兒NPHS2基因的全部8個外顯子及其啟動子全長,對PCR產物直接進行DNA序列測定。
　　 結果：在SDNS患兒NPHS2基因外顯子5上檢測到1個雜合錯義突變-596A>T；在NPHS2基因外顯子8上檢測到1個雜合同義突變-954T>C(A318A)。此外,在該患兒NPHS2基因啟動子區(qū)檢測到-116C>T純

18、合變異。其母親和弟弟NPHS2基因上也檢測到596A>T的雜合錯義突變和954T>C雜合同義突變。其母親NPHS2基因啟動子區(qū)也檢測到-116C>T純合變異。在其父親和弟弟NPHS2基因啟動子區(qū)檢測到-116C>T雜合變異。但患兒的父母和弟弟尿檢均正常。
　　 結論：本研究在1例SDNS中國兒童NPHS2基因編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了1個N199I雜合錯義突變和1個A318A雜合同義突變,在啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了-116C>T純合變異、提示該腎病綜合