丹參道地藥材cDNA芯片構建及毛狀根基因表達譜研究.pdf

1、丹參SalviamilitiorrhizaBge.為我國傳統(tǒng)名貴中藥材，具有活血化瘀，通經止痛的功效。丹參中主要含有脂溶性二萜醌類化合物和水溶性化合物，其中以丹參酮IIA為代表的二萜醌類化合物是治療心腦血管系統(tǒng)疾病的重要藥物。丹參種質層次不齊，不同產地質量差異懸殊，急需利用現代生物技術和分子生物學研究手段尋找次生代謝關鍵酶基因，明確影響其含量的關鍵因素，為培育優(yōu)良種質、提高組織培養(yǎng)和轉基因丹參中目的產物含量提供基礎。道地藥材是中藥材質量

2、控制的一項獨具特色的綜合判斷標準，為從基因水平闡釋道地藥材的形成機理，大規(guī)模尋找功能基因，本論文制作了首張道地藥材基因芯片，并對不同時期毛狀根進行基因表達譜研究，得到一批與次生代謝有關的基因，為丹參功能基因組學和道地藥材形成機理研究探索了新的思路和方法。 主要研究結果如下：1.構建了道地產區(qū)丹參根的cDNA噬菌體文庫，庫容為3×105，插入片段500～2500bp。 2.制作了包含4354個克隆的丹參cDNA芯片，它是首

3、張有關道地藥材的芯片。 3.得到114個在毛狀根不同時期差異表達的獨立基因(Unigene)。52個為丹參中首次報道。 4.利用NCBI的BLASTX和BLASTN工具對差異基因進行功能注釋，有92.10﹪的基因得到注釋。 5.67個基因得到“GO”注釋，分別歸入細胞組成、分子功能和生物過程三個分支。 6.26個基因涉及29個代謝相關的酶在KEGG“PATHWAY”中得到注釋，參與碳水化合物代謝、次生代謝

4、和氨基酸代謝的最多。 7.通過Northern點雜交檢驗5個基因在60天和30天材料中的表達情況，結果與芯片雜交結果完全一致。 8.首次得到1個丹參二萜生物合成基因的cDNA片段，copalyldiphosphatesynthase(CPS)。序列長度為1479bp，編碼418個氨基酸，為C末端。具有Terpene_cyclase_plant_C1保守區(qū)，為丹參酮類合成中的關鍵酶基因。 9.得到8個P450基因c

5、DNA片段，4個為首次報道。 10.首次從丹參中克隆8個基因全長序列。分別為2個Aldo-ketoreductase家族基因，2個金屬硫蛋白基因，雙烯內酯水解酶基因，翻譯控制腫瘤蛋白基因，類萌芽素蛋白基因及乙烯應答因子結合蛋白基因。 總之，本論文構建了以傳統(tǒng)藥用植物和道地藥材為研究主題的首張芯片，得到114個差異基因，52個為首次報道。利用BLAST、GO以及PATHWAY進行生物信息學分析，首次得到1個二萜生物合成基因