新生血管在翼狀胬肉形成中的作用及可能機(jī)制.pdf

1、翼狀胬肉是瞼裂部球結(jié)膜及其下纖維血管組織呈三角形增生并侵犯角膜的一種疾病，是臨床上常見和多發(fā)的眼科疾病之一。翼狀胬肉的研究歷史雖然已有兩千多年，但是迄今為止，其發(fā)病機(jī)制和復(fù)發(fā)原因仍然沒有被人類所認(rèn)知，對(duì)翼狀胬肉的研究仍然是眼科研究熱點(diǎn)之一。病理學(xué)證實(shí)胬肉組織中有大量纖維組織和新生血管，屬于增生性疾病，可推測(cè)新生血管在胬肉發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究證實(shí)微循環(huán)系統(tǒng)的微血管內(nèi)皮細(xì)胞在形態(tài)和功能上不同于作為通道血管的大血管內(nèi)皮細(xì)胞，研究發(fā)生在某

2、器官組織的血管病變最好是研究該組織的微血管內(nèi)皮細(xì)胞。目前國(guó)內(nèi)外尚沒有關(guān)于翼狀胬肉微血管方面的研究。本研究旨在探索建立體外分離和培養(yǎng)翼狀胬肉細(xì)胞的方法，并進(jìn)一步探討細(xì)胞之間的相互作用及其可能機(jī)制以及紫外線對(duì)細(xì)胞的作用，為進(jìn)一步研究新生血管在翼狀胬肉發(fā)病機(jī)制的作用研究打下基礎(chǔ)。 主要研究?jī)?nèi)容包括：一、翼狀胬肉細(xì)胞的體外分離和培養(yǎng)(一)研究目的在體外分離和培養(yǎng)翼狀胬肉細(xì)胞，建立研究翼狀胬肉發(fā)病機(jī)制的細(xì)胞模型。 (二)研究方法將

3、50例臨床手術(shù)切除的翼狀胬肉標(biāo)本無菌剪成1×1×1mm3組織塊，采用組織塊雙酶(胰蛋白酶和膠原酶)消化法消化30mins，血清終止消化后，200目金屬篩過濾后收集濾液，離心收集沉積物，用1640培養(yǎng)液和內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM+SFM)分別制成懸液，接種于培養(yǎng)瓶中。細(xì)胞生長(zhǎng)出來后，經(jīng)細(xì)胞鑒定(形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)和電鏡)和純化(選擇性培養(yǎng)基法、機(jī)械刮除法及密度梯度離心法)后，可得到翼狀胬肉成纖維細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞。 (三)研究

4、結(jié)果1、形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果翼狀胬肉組織塊接種后，鏡下36-48h有梭形細(xì)胞從組織塊爬出，3-4d形成細(xì)胞團(tuán)，5-6d形成漩渦狀生長(zhǎng)，從形態(tài)上初步認(rèn)定為成纖維樣細(xì)胞，該細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，核位于中部，呈漩渦狀生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度較快。48-72h有三角形或多邊形細(xì)胞從組織塊爬出，5-7d形成克隆樣細(xì)胞團(tuán)，逐漸向周圍生長(zhǎng)，10-14d形成單層細(xì)胞，初步認(rèn)定為內(nèi)皮細(xì)胞樣細(xì)胞，該細(xì)胞呈三角形或多邊形單層生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度較慢。50例樣本均有成纖維細(xì)胞，37例培養(yǎng)出

5、內(nèi)皮細(xì)胞樣細(xì)胞。 2、免疫組化和電鏡鑒定結(jié)果采用SABC免疫組化法檢測(cè)獲得的細(xì)胞。成纖維細(xì)胞VIM表達(dá)陽性，表現(xiàn)為胞漿呈棕褐色，細(xì)沙粒狀著色。微血管內(nèi)皮細(xì)胞第Ⅷ因子相關(guān)抗原和CD34分子表達(dá)陽性，表現(xiàn)胞漿呈棕褐色，細(xì)沙粒狀著色；CD31分子表達(dá)陰性。 透射電鏡觀察，微血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中見大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體等細(xì)胞器，并可見內(nèi)皮細(xì)胞特征結(jié)構(gòu)W-P小體。 3、細(xì)胞純化結(jié)果純化前，成纖維細(xì)胞及微血管內(nèi)皮細(xì)胞混雜在一起

6、；經(jīng)過分離和純化后，可將成纖維細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞分開，得到成纖維細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞。 (四)研究結(jié)論翼狀胬肉標(biāo)本通過雙酶消化法在體外可以分離和培養(yǎng)，并經(jīng)鑒定和純化后得到翼狀胬肉微血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，方法簡(jiǎn)便，可操作性強(qiáng)，為研究翼狀胬肉的發(fā)病機(jī)制提供細(xì)胞模型。 二、細(xì)胞之間的相互作用(一)、研究目的探討翼狀胬肉中微血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間的相互作用，以及它們?cè)谝頎铈廊獍l(fā)病機(jī)制中的角色。 (二)、研究方

7、法收集臨床翼狀胬肉標(biāo)本，采用翼狀胬肉微血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)、條件培養(yǎng)和共同培養(yǎng)的方法形成不同培養(yǎng)體系，通過ELISA和RT-PCR等方法檢測(cè)三種培養(yǎng)體系中兩種細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞中VEGF和bFGF的蛋白和RNA含量變化。 (三)、研究結(jié)果1、從細(xì)胞上清液中VEGF和bFGF的含量表達(dá)來看，微血管內(nèi)皮細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，條件培養(yǎng)和共同培養(yǎng)三個(gè)體系相比，細(xì)胞因子的表達(dá)呈現(xiàn)明顯升高的趨勢(shì)(P＜0.05)；成纖維細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，條

8、件培養(yǎng)和共同培養(yǎng)三者相比，細(xì)胞因子的表達(dá)同樣呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)(P＜0.05)； 2、細(xì)胞上清液中的細(xì)胞因子在分泌后，隨時(shí)間變化有明顯的線性降解。VEGF的降解過程，PEC明顯快于PF；bFGF的降解過程，PEC和PF趨勢(shì)相近； 3、從細(xì)胞中VEGF和bFGF的RNA含量表達(dá)來看，微血管內(nèi)皮細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，條件培養(yǎng)和共同培養(yǎng)三個(gè)體系相比，RNA的表達(dá)明顯升高(P＜0.01)；成纖維細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，條件培養(yǎng)和共同培養(yǎng)三個(gè)體系相比，

9、bFGF的表達(dá)同樣呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)(P＜0.05)； (四)、研究結(jié)論1、微血管內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF和bFGF的RNA表達(dá)和細(xì)胞上清液中VEGF和bFGF的蛋白表達(dá)水平有共同趨勢(shì)：共同培養(yǎng)＞條件培養(yǎng)＞單獨(dú)培養(yǎng)； 2、成纖維細(xì)胞中VEGF和bFGF的RNA表達(dá)和細(xì)胞上清液中VEGF和bFGF的蛋白表達(dá)水平有共同趨勢(shì)：共同培養(yǎng)＞條件培養(yǎng)＞單獨(dú)培養(yǎng)； 3、微血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞有相互上調(diào)作用，兩種細(xì)胞在翼狀胬肉的發(fā)生發(fā)

10、展過程中相互促進(jìn)。 三、細(xì)胞因子及其受體的改變(一)、研究目的檢測(cè)并探討細(xì)胞因子及其受體的變化及其可能機(jī)制。 (二)、研究方法收集臨床原發(fā)翼狀胬肉標(biāo)本20例和正常結(jié)膜10例，每一例標(biāo)本對(duì)稱切成兩份。一份制成石蠟和冰凍切片，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)VEGF和bFGF兩種細(xì)胞因子及其相應(yīng)受體VEGFR2和FGFR1在翼狀胬肉和結(jié)膜中的表達(dá)；另一份(1)組織勻漿離心后提取上清液采用ELISA和Westernblot技術(shù)檢測(cè)VE

11、GF和bFGF兩種細(xì)胞因子含量改變，(2)提取RNA后采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)VEGFR2和FGFR1的RNA在翼狀胬肉和結(jié)膜中的改變； (三)、研究結(jié)果1、免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示VEGF主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞及其周圍，而bFGF主要表達(dá)在成纖維細(xì)胞及其周圍；VEGFR2和FGFR1主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜上，在成纖維細(xì)胞胞膜上也有少量表達(dá)； 2、ELISA和Westernblot結(jié)果表明VEGF含量在翼狀胬肉中明顯要強(qiáng)

12、于結(jié)膜，而bFGF的表達(dá)在胬肉和結(jié)膜中沒有差異； 3、RT-PCR結(jié)果證實(shí)VEGFR2表達(dá)在翼狀胬肉中明顯高于結(jié)膜，而FGFR1表達(dá)結(jié)膜高于翼狀胬肉。 (四)、研究結(jié)論1、翼狀胬肉組織中VEGF的表達(dá)高于結(jié)膜；而bFGF表達(dá)在兩種組織中沒有差異； 2、VEGFR2的表達(dá)翼狀胬肉明顯高于結(jié)膜，而FGFR1的表達(dá)則是結(jié)膜高于翼狀胬肉，提示翼狀胬肉中血管生產(chǎn)通過VEGF誘導(dǎo)途徑。 四、紫外線對(duì)細(xì)胞的作用(一)、

13、研究目的通過研究紫外線對(duì)翼狀胬肉細(xì)胞模型的作用，探討紫外線和翼狀胬肉發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系； (二)、研究方法收集臨床翼狀胬肉標(biāo)本，采用翼狀胬肉微血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)、條件培養(yǎng)和共同培養(yǎng)的方法形成不同培養(yǎng)體系，1用MTT方法選擇紫外線照射細(xì)胞的適宜強(qiáng)度，2采用MTT法繪制在強(qiáng)度為20mJ/cm2的紫外線照射下兩種細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的改變，3通過ELISA和RT-PCR等方法檢測(cè)在強(qiáng)度為20mJ/cm的紫外線照射下三種培養(yǎng)體系中

14、兩種細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞中VEGF和bFGF的蛋白和RNA含量變化。 (三)、研究結(jié)果1、通過不同強(qiáng)度紫外線照射細(xì)胞活性的實(shí)驗(yàn)，PEC和PF兩種細(xì)胞都在20mJ/cm2的照射強(qiáng)度下細(xì)胞活性保持較好，故選擇20mJ/cm2的照射強(qiáng)度作為實(shí)驗(yàn)中照射基數(shù)； 2、PEC和PF兩種細(xì)胞在紫外線(20mJ/cm2)照射下，細(xì)胞活性都下降，生長(zhǎng)速度下降，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)間延遲； 3、PEC受紫外線照射后VEGF的RNA含量和上

15、清液VEGF蛋白含量在單獨(dú)培養(yǎng)體系中，照射組較未照射組有明顯下降，差異有顯著性意義(P＜0.05)；PF受紫外線照射后VEGF的RNA含量和上清液VEGF含量在單獨(dú)培養(yǎng)體系和條件培養(yǎng)體系中，照射組較未照射組有明顯下降，差異有顯著性意義(P＜0.05)， 4、PEC和PF兩種細(xì)胞受紫外線照射后bFGF的RNA含量以及細(xì)胞上清液中bFGF的蛋白含量改變有共同趨勢(shì)：?jiǎn)为?dú)培養(yǎng)體系、條件培養(yǎng)體系和共同培養(yǎng)體系中照射組較未照射組呈明顯下降改