花色苷提取物對(duì)血脂異?；颊哐挠绊懠皺C(jī)制探討.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)引起的心血管疾病(cardiovasculardisease，CVD)已成為威脅人類健康的主要疾病之一，其患病率與死亡率居高不下。升高的甘油三酯(triglycerides，TG)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)水平是AS的危險(xiǎn)因素。在過去的幾十年中，許多關(guān)于CVD干預(yù)研究都是關(guān)注于如何降低LDL的水平。然而，最

2、近的研究表明，血清高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)水平與AS的發(fā)病危險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，并獨(dú)立于血清TG和LDL的水平。因此升高HDL水平是治療AS的一項(xiàng)重要策略。
　　 HDL的抗AS作用可涉及多種機(jī)制，如抗氧化、抗炎和抗血栓等，但其最主要的作用機(jī)制在于參與膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)(reverse cholesterol transport，RCT)過程。RCT是指體內(nèi)多余的膽固醇從外周組織(如巨噬

3、細(xì)胞、泡沫細(xì)胞、AS斑塊等)通過HDL轉(zhuǎn)運(yùn)回肝臟代謝，以膽鹽或者糞膽固醇的形式排出體外的過程。RCT的效率依賴于巨噬細(xì)胞膽固醇外流、卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(lecithin cholesterol acyltransferase，LCAT)、膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(cholesterylester transfer protein，CETP)和肝臟通過B類I型清道夫受體對(duì)于HDL攜帶的膽固醇酯的選擇性攝取、代謝等過程。這些因素都決定了HDL發(fā)

4、揮功能。
　　 飲食干預(yù)(包括膳食模式和膳食組分等)是防治AS的一項(xiàng)重要策略。自然界的一些植物性食物中，存在著大量的非營養(yǎng)性生物活性物質(zhì)或稱植物化學(xué)物，具有獨(dú)特的健康促進(jìn)和疾病防治等作用。大量的研究表明，植物化學(xué)物具有預(yù)防AS的有益作用。其中，花色苷(anthocyanin)就是這樣一類具有防治疾病作用的植物化學(xué)物。花色苷屬于多酚類化合物，是一類在自然界廣泛存在的水溶性色素。已證實(shí)富含花色苷的食物提取物在體外具有抗氧化特性。近年

5、來的研究表明，花色苷在細(xì)胞和動(dòng)物模型都具有廣泛的生物學(xué)活性，比如抗氧化，抗炎，抗AS，改善血脂、和抗腫瘤等。在動(dòng)物模型(包括膳食誘導(dǎo)和遺傳型的高脂動(dòng)物模型)，補(bǔ)充富含花色苷的食物或其提取物都可以降低血清TG、總膽固醇(total cholesterol，TC)和非HDL-C水平，以及升高血清HDL-C和載脂蛋白A I(apolipoprotein A I，apoA I)水平。進(jìn)一步研究表明，花色苷在體外可以促進(jìn)小鼠巨噬泡沫細(xì)胞的膽固醇外

6、流，這也可能是花色苷發(fā)揮改善血脂作用的一條可能途徑。
　　 人類的脂質(zhì)代謝和嚙齒類動(dòng)物存在許多差異。因此，花色苷在人類是否具有同樣有益的改善血脂的作用，還需要進(jìn)一步的研究。本課題擬采用從越橘和黑加侖提取到的純化花色苷作為干預(yù)因素，觀察對(duì)于血脂異?；颊哐爸x酶(LCAT和CETP)的影響，并對(duì)可能的機(jī)制進(jìn)行探討，以進(jìn)一步明確花色苷在防治AS及心血管疾病中的應(yīng)用價(jià)值。
　　 研究對(duì)象和方法：
　　 1.干預(yù)材料

7、
　　 花色苷膠囊(Medox)和空白安慰劑膠囊均由挪威polyphenols AS公司提供，采用統(tǒng)一包裝?；ㄉ漳z囊中的花色苷由越橘(Vaccinium myrtillus)和黑加侖(Ribes nigrum)中提取，包括17種天然花色苷，總含量為80mg。
　　 2.研究對(duì)象
　　 本課題在廣州市多個(gè)社區(qū)以招募志愿者的形式進(jìn)行研究。研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)如下：
　　 入選標(biāo)準(zhǔn)為：①年齡40～65歲，廣州市常

8、住居民；②符合我國“血脂異常防治建議”對(duì)于原發(fā)性高脂血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)中的2項(xiàng)及以上：空腹血清TC≥200mg/dL(5.2 mmol/L)；TG≥150mg/dL(1.7mmol/L)；LDL-C≥120 mg/dL(3.1mmol/L)；HDL-C≤35 mg/dL(0.9mmol/L)；③要求進(jìn)餐規(guī)律，較少外出就餐，近三個(gè)月體重穩(wěn)定。
　　 排除標(biāo)準(zhǔn)為：①患有臨床診斷的心腦血管疾病，各種嚴(yán)重的慢性疾病，肝腎功能不全；②試驗(yàn)前一個(gè)

9、月內(nèi)曾患有急慢性感染性疾病、外傷或手術(shù)；③現(xiàn)正服用或近半年內(nèi)曾服用過任何影響血脂的藥物。
　　 剔除標(biāo)準(zhǔn)為：①試驗(yàn)期間，研究對(duì)象發(fā)生由于非干預(yù)因素導(dǎo)致的嚴(yán)重疾??；②連續(xù)3天未服用干預(yù)保健品者。
　　 本課題獲得中山大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。
　　 3.試驗(yàn)設(shè)計(jì)
　　 本研究采用隨機(jī)、雙盲、對(duì)照試驗(yàn)。參考文獻(xiàn)確定花色苷的干預(yù)劑量為320mg/d。研究所需的樣本量大小依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果確

10、定為120例。篩選符合研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)的志愿者120名，按照年齡采用匹配隨機(jī)化的方式分為兩組，花色苷組和對(duì)照組，每組各60人(21名男性和39名女性)?；ㄉ战M研究對(duì)象給予花色苷膠囊，每日兩次，每次兩粒，于早飯和晚飯半小時(shí)后服用，每日服用花色苷的劑量為320mg；對(duì)照組研究對(duì)象給予空白安慰劑膠囊，服用方法與花色苷膠囊相同。干預(yù)試驗(yàn)共12周，期間研究對(duì)象保持原來的飲食生活習(xí)慣，每4周隨訪1次，回收剩余膠囊，詢問并記錄服用膠囊的情況以及有無

11、出現(xiàn)不良反應(yīng)及種類，并發(fā)放下一階段的膠囊。
　　 4.研究指標(biāo)
　　 (1)問卷調(diào)查
　　 干預(yù)前(0周)和干預(yù)結(jié)束時(shí)(12周)，所有研究對(duì)象進(jìn)行膳食問卷調(diào)查(包括3天24小時(shí)回顧性調(diào)查表和食物頻數(shù)表)，基本情況和生活方式調(diào)查。由統(tǒng)一培訓(xùn)的調(diào)查員詢問研究對(duì)象，并根據(jù)其回答如實(shí)填寫問卷。3天24小時(shí)回顧性調(diào)查表包括2個(gè)工作日和1個(gè)周日，采用CDGSS3.0軟件分析，以評(píng)價(jià)研究對(duì)象的能量和營養(yǎng)素?cái)z入情況。個(gè)人基本情況

12、調(diào)查包括對(duì)象的一般情況、既往史、家族史、服藥史等，用于研究對(duì)象的篩查。生活方式調(diào)查包括吸煙、飲酒、運(yùn)動(dòng)習(xí)慣等。
　　 (2)體格測(cè)量
　　 干預(yù)前(0周)和干預(yù)結(jié)束時(shí)(12周)，以及每次隨訪(4周和8周)時(shí)，所有研究對(duì)象均測(cè)量身高、體重、腰臀圍和血壓，計(jì)算體質(zhì)指數(shù)(bodymass index，BMI)和腰臀比(waist-to-hip ratio，WHR)。
　　 (3)尿液中花色苷及其代謝物檢測(cè)
　　

13、 干預(yù)前(0周)和干預(yù)結(jié)束時(shí)(12周)，研究對(duì)象均于清晨空腹收集尿液10ml，立即用2.5％體積的6mol/L HCl酸化。加入內(nèi)標(biāo)(矢車菊素-3，5-O-β-葡萄糖苷)后，采用固相萃取方法提取純化尿樣中的花色苷，HPLC法檢測(cè)樣品中的花色苷及其代謝物的種類和含量。
　　 (4)血液指標(biāo)檢測(cè)
　　 干預(yù)前(0周)和干預(yù)結(jié)束時(shí)(12周)，研究對(duì)象均于清晨空腹采集肘前靜脈血，分離血清或血漿用于血液指標(biāo)檢測(cè)。
　　 1

14、)安全性指標(biāo)檢測(cè)
　　 2)血脂和血糖濃度檢測(cè)
　　 3)血漿脂代謝酶水平檢測(cè)
　　 4)血清在體外促進(jìn)J774小鼠巨噬細(xì)胞膽固醇外流的能力檢測(cè)
　　 5.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　 人HepG2細(xì)胞以3.5×105細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板，添加10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基孵育24小時(shí)。然后，采用不同濃度(0，1,5，10，20，40μmol/L)的矢車菊素-3-o-β-葡萄糖苷(cyanidin3

15、-O-β-glucosides，Cy-3-G)的無血清培養(yǎng)基孵育細(xì)胞24小時(shí)。收集細(xì)胞培養(yǎng)液分為兩部分：一部分直接采用ELISA法測(cè)定CETP的濃度；另一部分立即添加0.05％ NaN3，0.5 IU/ml Aprotinin和1mMEDTA，pH7.4，離心除去細(xì)胞沉淀后，采用熒光法檢測(cè)CETP活性。收集細(xì)胞采用Trizol法提取mRNA，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)CETP mRNA表達(dá)水平。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.試

16、驗(yàn)完成情況
　　 2.研究對(duì)象的一般情況
　　 3.膳食及營養(yǎng)素?cái)z入情況
　　 4.人體測(cè)量指標(biāo)
　　 5.尿液中花色苷的代謝情況
　　 6.血常規(guī)和肝腎功能指標(biāo)
　　 7.血脂、血糖和胰島素水平
　　 8.脂代謝酶水平
　　 9.血脂和脂代謝酶的關(guān)系
　　 10.膽固醇外流水平
　　 11.體外花色苷對(duì)于CETP的影響
　　 結(jié)論：