桑枝提取物降血脂活性物質(zhì)研究.pdf

1、“三高”即高血脂、高血壓和高血糖，被稱為人類健康的“無形殺手”，其中高血脂不僅可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、脂肪肝、冠心病等心血管疾病，而且與高血壓、高血糖等相關(guān)疾病關(guān)系密切，嚴(yán)重威脅人類健康。高脂血癥主要是由血漿中甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）和類脂（lipid，LP）含量持續(xù)過高引發(fā)，其中 TG影響尤為突出。TG被脂肪水解酶（簡(jiǎn)稱脂肪酶，lipase）在腸粘膜細(xì)胞內(nèi)水解生成甘油

2、（甘油二酯或單酯）和脂肪酸，大量的脂肪酸在脂肪合成酶作用下，在肝臟中再次形成TG，從而引起血脂水平上升。同時(shí)，細(xì)胞代謝會(huì)產(chǎn)生大量自由基，而血液中過量的自由基更易通過氧化或修飾脂蛋白膽固醇，使脂質(zhì)水平上升。已有研究表明，具有強(qiáng)自由基清除能力的抗氧化活性化合物黃酮和多酚類物質(zhì)，可通過抑制TG合成過程中關(guān)鍵酶的催化活性，下調(diào)血清中TG水平，從而達(dá)到降血脂目的。
　　國內(nèi)外大量研究證實(shí)，桑樹各部位的提取物均具有降血脂功效。其中，桑葉、桑根

3、和桑椹的報(bào)道較多，但關(guān)于桑枝抑制脂肪酶活性的研究，特別是在脂肪酶活性跟蹤下，從桑枝中分離出具有抑制脂肪酶作用的活性物質(zhì)的研究鮮有報(bào)道。研究表明，逆境環(huán)境（過酸過堿、干旱脅迫等）或誘導(dǎo)處理（物理誘導(dǎo)、化學(xué)誘導(dǎo)、生物誘導(dǎo)等）會(huì)影響植物部分次生代謝產(chǎn)物的含量和種類，故本論文旨在對(duì)誘導(dǎo)處理后的桑枝進(jìn)行降血脂活性研究，并在抑制脂肪酶活性跟蹤下，尋找天然的脂肪酶抑制劑，以期為桑資源的開發(fā)提供理論依據(jù)，為開發(fā)降血脂藥物提供新思路。具體研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如

4、下：
　　1桑枝降血脂活性部分的篩選
　　為了科學(xué)、快速定位降血脂活性萃取部分，本研究對(duì)誘導(dǎo)后桑枝粗提物各萃取部分進(jìn)行了總多酚、總黃酮含量測(cè)定，及抑制脂肪酶、降膽固醇、清除 DPPH自由基（DPPH?）清除力、保護(hù)DNA潛力等降血脂相關(guān)活性的測(cè)試，結(jié)果表明各萃取部分差異明顯。桑枝粗提物的乙酸乙酯萃取部分（TEE）的多酚與黃酮總含量（247.79 mg/g）顯著高于石油醚萃取部分（TPE）（57.19 mg/g）、正丁醇萃取部

5、分（TBE）（138.20 mg/g）和剩余水相部分（TWE）（43.15 mg/g）（P＜0.05）；TEE（IC50為1.06±0.08 mg/mL）對(duì)脂肪酶抑制作用顯著強(qiáng)于TPE（IC50>12.80 mg/mL）、TBE（IC50為6.39±0.98 mg/mL）和TWE（IC50為11.21±1.98 mg/mL）（P＜0.05）；對(duì)清除DPPH?的能力（IC50為0.24±0.01 mg/mL）也遠(yuǎn)強(qiáng)于TPE（IC50為0.

6、77±0.10 mg/mL）、TBE（IC50為10.35±1.12 mg/mL）和TWE（IC50為12.18±1.80 mg/mL）（P＜0.05）。結(jié)果表明：TEE各降血脂相關(guān)活性均最佳。
　　2抑制脂肪酶活性成分的分離與鑒定
　　為了直接定位降血脂活性成分，本研究在抑制脂肪酶活性跟蹤下，對(duì)TEE中具有脂肪酶抑制活性的成分進(jìn)行分離鑒定。首先，基于不同填料的柱色譜（硅膠柱色譜、氧化鋁柱色譜、Sephadex LH-20凝

7、膠柱色譜）及重結(jié)晶等分離手段，在薄層層析-自顯影技術(shù)（TLC-自顯影技術(shù)）和脂肪酶抑制活性的跟蹤下，通過高通量篩選法，結(jié)合TLC-自顯影技術(shù)，從TEE（85.6 g）中分離得到6個(gè)具有顯著脂肪酶抑制活性的化合物。其次，基于理化性質(zhì)分析結(jié)果，利用TLC、高效液相色譜（HPLC）法，將所分離得到的活性物質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)，應(yīng)用核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（MS）進(jìn)行結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)分析。最終確定 MT4~7分別為蘆丁、槲皮素、桑色素、氧化白藜蘆醇， M

8、T1、MT’2結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步分析確定。
　　3單體化合物抑制脂肪酶活性檢測(cè)及活性機(jī)制初探
　　首先，由MT1、MT’2、蘆丁、槲皮素、桑色素和氧化白藜蘆醇的脂肪酶抑制活性檢測(cè)結(jié)果分析可知：MT’2的抑制作用最強(qiáng)（IC50為0.12 mg/mL），其次為槲皮素（IC50為2.04 mg/mL）、MT1（IC50為0.99 mg/mL）、蘆?。↖C50為1.89 mg/mL）、桑色素（IC50為2.19 mg/mL）以及氧化白藜

9、蘆醇（IC50為13.80 mg/mL）。
　　其次，應(yīng)用AutoDock程序，采用分子對(duì)接手段，尋找槲皮素和脂肪酶合理的構(gòu)象和取向，得出槲皮素與脂肪酶是通過氫鍵結(jié)合，即1）槲皮素5-OH的H原子與脂肪酶ASP-248的H形成氫鍵，距離為2.8?；2）槲皮素7-OH的H原子分別與脂肪酶ASP-332和ARG-266殘基中的O形成兩個(gè)氫鍵，鍵長(zhǎng)分別為2.2?和2.3?；3）槲皮素7-OH的O原子則與脂肪酶LYS-240的H形成氫鍵，