龜鹿二仙膠對去卵巢大鼠骨代謝的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本課題采用動物實(shí)驗(yàn)方法觀察龜鹿二仙膠對去卵巢大鼠骨代謝指標(biāo)、力學(xué)性能和骨顯微結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)一步通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察其對rBMSCs增殖和成骨分化的作用并探討其作用機(jī)制，希望為臨床應(yīng)用龜鹿二仙膠防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從微觀角度為“腎主骨”理論提供實(shí)驗(yàn)支持。
　　方法：
　　1、去卵巢大鼠骨代謝、力學(xué)性能及骨顯微結(jié)構(gòu)的改變及龜鹿二仙膠的干預(yù)作用
　　選用3月齡SD大鼠72只隨機(jī)分假手術(shù)組、模型組、

2、實(shí)驗(yàn)組（龜鹿二仙膠高、中、低劑量組）和對照組（雷奈酸鍶組），每組各12只，除假手術(shù)組外其余各組均切除卵巢造模，造模后實(shí)驗(yàn)組予以龜鹿二仙膠高、中、低劑量干預(yù)，對照組予以雷奈酸鍶干預(yù)，術(shù)后第12周取材。采用Elisa法檢測大鼠血清E2、 BALP、OC、TRACP-5b和尿DPD濃度，DEXA法測大鼠腰椎和股骨BMD，骨形態(tài)計(jì)量學(xué)方法分析大鼠腰椎、股骨髁部骨顯微結(jié)構(gòu)的變化，腰椎壓縮和股骨三點(diǎn)彎曲方法檢測腰椎和股骨最大載荷，觀察龜鹿二仙膠對去

3、卵巢大鼠骨代謝、骨顯微結(jié)構(gòu)和骨骼力學(xué)性能的影響。
　　2、龜鹿二仙膠含藥血清對rBMSCs增殖、成骨分化的影響
　　采用血清藥理學(xué)方法制備大鼠龜鹿二仙膠（用藥及劑量同實(shí)驗(yàn)第一部分）含藥血清。全骨髓貼壁法分離rBMSCs，傳代培養(yǎng)至F3代并通過形態(tài)觀察、MTT法繪制生長曲線和FCM法檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物（CD45和CD90）鑒定。以F3代細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，分別用濃度為10％含藥血清（高、中、低劑量組）、20％含藥血清（高、中、低劑

4、量組）、10％ FBS、10％和20％空白組血清干預(yù)，MTT法檢測細(xì)胞活性，F(xiàn)ACS法檢測細(xì)胞周期方法觀察龜鹿二仙膠含藥血清對rBMSCs增殖的影響，并確定促rBMSCs增殖含藥血清的最佳干預(yù)濃度。采用確定的最佳干預(yù)濃度的含藥血清干預(yù)F3代細(xì)胞，并用經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑、10％FBS和10％空白血清為對照，分別于干預(yù)7、14和21d后，用ALP比活性檢測龜鹿二仙膠含藥血清對ALP活性的影響。干預(yù)21d后茜素紅(ARS)染色和RT-PCR方法檢

5、測rBMSCs種ALP、OC mRNA的表達(dá)。
　　3、龜鹿二仙膠含藥血清對Wnt/β-catenin信號通路的影響
　　用10％濃度的龜鹿二仙膠中劑量組含藥血清干預(yù)F3代rBMSCs21d后，分別用RT-PCR和Western-Blot方法檢測Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)因子Wnt5a、Fzd-2、 Axin-2、β-catenin、Lef-1 mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.去卵巢大鼠骨

6、代謝、力學(xué)性能及骨顯微結(jié)構(gòu)的改變及龜鹿二仙膠的干預(yù)作用切除卵巢后，與假手術(shù)組相比，大鼠血清E2、BALP均顯著降低，血清OC和TRACP-5b尿DPD濃度均升高;腰椎及股骨BMD、最大載荷均顯著降低;腰椎和股骨Tb.Ar、Tb.Th、Tb.N均顯著低于假手術(shù)組，TB.Sp則顯著高于假手術(shù)組，骨骼呈骨質(zhì)疏松改變。
　　12周后，龜鹿二仙膠各劑量組和雷奈酸鍶組血清E2水平均顯著高于模型組，但不同劑量作用存在差異，高、低劑量組顯著高于中

7、劑量組和假手術(shù)組。龜鹿二仙膠中、高劑量組和雷奈酸鍶組OC和BALP水平顯著高于模型組，低、中劑量組BALP高于高劑量組。龜鹿二仙膠低劑量組血清TRACP-5b水平顯著降低，低、中劑量組尿DPD水平顯著降低，低于其余各組。龜鹿二仙膠中、高劑量組骨密度較模型組增高，但低于假手術(shù)組和雷奈酸鍶組。龜鹿二仙膠各劑量組腰椎和股骨最大載荷增高，對股骨最大載荷的作用各劑量組間差異不明顯，但中劑量組對腰椎最大載荷增高作用最顯著。與模型組比較，龜鹿二仙膠各

8、劑量組腰椎和股骨髁部Tb.Ar、Tb.Th和Tb.N顯著增高，Tb.Sp顯著降低，以中劑量作用最顯著。
　　2.龜鹿二仙膠含藥血清對rBMSCs增殖和成骨分化的影響
　　F3代rBMSCs呈均勻一致的長梭形，典型旋渦狀生長;MTT法繪制生長曲線，F(xiàn)CM法檢測F3代細(xì)胞CD45陽性表達(dá)率為1.46±0.23％，CD90陽性表達(dá)率為96.97±3.21％，符合BMSCs特征。MTT法和FACS檢測結(jié)果顯示龜鹿二仙膠含藥血清能明顯

9、促進(jìn)F3代rBMSCs增殖，最佳干預(yù)條件是為10％濃度的龜鹿二仙膠中劑量組含藥血清。
　　以10％濃度的龜鹿二仙膠中劑量組含藥血清干預(yù)F3代細(xì)胞，第7d、14d和21d龜鹿二仙膠含藥血清組和經(jīng)典誘導(dǎo)成骨組ALP比活性顯著高于胎牛血清組和空白血清組，且該兩組細(xì)胞ALP比活性隨培養(yǎng)天數(shù)增加升高更顯著，呈時間相關(guān)性，但兩組間ALP比活性無顯著性差異。21d時茜素紅染色可見龜鹿二仙膠含藥血清組和經(jīng)典誘導(dǎo)成骨組中rBMSCs橘紅色鈣結(jié)節(jié)生成

10、，RT-PCR結(jié)果顯示該兩組rBMSCs的ALP和OCmRNA表達(dá)均顯著增高。
　　3.龜鹿二仙膠含藥血清對Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)因子mRNA和蛋白表達(dá)的影響
　　RT-PCR結(jié)果顯示龜鹿二仙膠含藥血清組rBMSCs中Wnt5a、Fzd-2、β-catenin和VIILef-1 mRNA均顯著高于空白血清組和胎牛血清組，Axin-2 mRNA表達(dá)顯著低于其余各組。經(jīng)典成骨誘導(dǎo)組Wnt5a和β-catenin

11、mRNA表達(dá)顯著高于胎牛血清組和空白血清組，與龜鹿二仙膠含藥血清組無顯著性差異;Fzd-2和Lef-1 mRNA表達(dá)與胎牛血清組和空白血清組無顯著性差異，顯著低于龜鹿二仙膠含藥血清組;Axin-2 mRNA的表達(dá)與胎牛血清組和空白血清組無顯著性差異，但顯著高于龜鹿二仙膠含藥血清組。
　　Western-Blot結(jié)果顯示龜鹿二仙膠含藥血清組rBMSCs中Wnt5a、Fzd-2、β-catenin和Lef-1蛋白表達(dá)均顯著高于空白血清

12、組和胎牛血清組，Axin-2蛋白表達(dá)顯著低于其余各組。經(jīng)典成骨誘導(dǎo)組Wnt5a和β-catenin蛋白表達(dá)顯著高于胎牛血清組和空白血清組，與龜鹿二仙膠含藥血清組無顯著性差異;Fzd-2蛋白表達(dá)與胎牛血清組和空白血清組無顯著性差異，顯著低于龜鹿二仙膠含藥血清組;Axin-2蛋白表達(dá)顯著低于胎牛血清組和空白血清組，但顯著高于龜鹿二仙膠含藥血清組;Lef-1蛋白表達(dá)顯著高于胎牛血清組和空白血清組，但顯著低于龜鹿二仙膠含藥血清組。
　　結(jié)

13、論：
　　1.龜鹿二仙膠對去卵巢大鼠骨骼具有促進(jìn)骨生成和抑制骨吸收的雙重作用，既增加骨密度，又同時增加骨小梁面積、寬度和節(jié)點(diǎn)數(shù)，明顯改善骨顯微結(jié)構(gòu)，最終增強(qiáng)去卵巢大鼠骨強(qiáng)度。
　　2.10％濃度的龜鹿二仙膠中劑量組含藥血清能促進(jìn)rBMSCs增殖，能通過增強(qiáng)Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)因子wnt5a、β-catenin、Fzd-2、Lef-1活性，并抑制Axin-2活性，激活Wnt/β-catenin信號通路，從而促