龜鹿二仙膠不同提取部位對體外培養(yǎng)豚鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性的影響.pdf

1、目的:
　　通過觀察龜鹿二仙膠不同提取部位含藥血清對豚鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原、蛋白黏多糖、Bcl-2及MMP-3的影響，從細(xì)胞、分子水平闡述龜鹿二仙膠不同提取部位對豚鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的作用機(jī)制，篩選龜鹿二仙膠的有效部位，為龜鹿二仙膠新藥的研發(fā)提供參考。
　　方法:
　　1.龜鹿二仙膠應(yīng)用溶劑極性依次遞增分離法，制備三氯甲烷、正丁醇、水提取物。
　　2.Wistar大鼠隨機(jī)分組并分別用龜鹿二仙膠的3提取物連續(xù)灌胃7天

2、后，采血制備含藥血清。
　　3.采用三月齡豚鼠軟骨細(xì)胞建立體外培養(yǎng)體系。
　　4.MTT比色法描繪各代豚鼠軟骨細(xì)胞增殖生長曲線，確定各組含藥血清干預(yù)時間。
　　5.應(yīng)用免疫組化方法觀察各組含藥血清對軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)的影響。
　　6.應(yīng)用AB及PAS法觀察各組含藥血清對軟骨細(xì)胞蛋白黏多糖表達(dá)。
　　7.應(yīng)用RTF-QPCR法觀察各組含藥血清對軟骨細(xì)胞bcl-2基因的表達(dá)。
　　8.應(yīng)用ELISA法觀

3、察各組含藥血清對軟骨細(xì)胞MMP-3的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.甲苯胺藍(lán)染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色均為陽性，提示成功建立豚鼠軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。
　　2.MTT比色法結(jié)果:各組含藥血清干預(yù)軟骨細(xì)胞48h促增殖藥效最佳。
　　3.免疫組化結(jié)果:三種不同提取部位的含藥血清表達(dá)均較對照組提高(P＜0.05)，醇提組＞水提組＞烷提組＞對照組(P＜0.05)。
　　4.高碘酸希爾染色(PAS)法結(jié)果:三種不同提取部

4、位的含藥血清陽性表達(dá)均較對照組提高(P＜0.05)，醇提組＞水提組＞烷提組＞對照組(P＜0.05)。
　　5.阿新蘭染色法(AB)結(jié)果:三種不同提取部位的含藥血清陽性表達(dá)均較對照組提高(P＜0.05)，醇提組＞水提組＞烷提組＞對照組(P＜0.05)。
　　6.熒光定量PCR結(jié)果:與對照組相比，三種不同提取部位的含藥血清均能顯著上調(diào)bcl-2基因的表達(dá)(P＜0.05);醇提組＞水提組＞烷提組＞對照組(P＜0.05)。
　

5、　7.ELISA法結(jié)果:與對照組比較，三種不同提取部位的含藥血清均能明顯抑制MMP-3的表達(dá)(P＜0.05)，抑制MMP-3的效果為:醇提組＞水提組＞烷提組＞對照組(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　龜鹿二仙膠主要提取物甾體類生物激素、多糖類和脂肪酸類物質(zhì)能夠不同程度促進(jìn)豚鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞蛋白黏多糖、Ⅱ型膠原、bcl-2基因表達(dá)，抑制MMP-3的表達(dá)，從而提高豚鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的活性，抑制軟骨細(xì)胞的凋亡，其中醇提取部位藥效最佳，