交叉韌帶損傷后滑膜成纖維細(xì)胞中賴氨酰氧化酶和基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的研究.pdf

1、膝關(guān)節(jié)交叉韌帶損傷后愈合能力差一直是骨科臨床治療面臨的難題。因此從分子水平闡明交叉韌帶難以愈合的原因至關(guān)重要。
　　交叉韌帶受到損傷的同時滑膜也會受到不同程度損傷。動物實驗發(fā)現(xiàn)前交叉韌帶(Anterior cruciate ligament, ACL)損傷后，與關(guān)節(jié)腔內(nèi)其它組織（如：后交叉韌帶(Posterior cruciate ligament, PCL)、半月板和軟骨）相比，滑膜向關(guān)節(jié)液釋放了最大量活化形式的基質(zhì)金屬蛋白酶(

2、Matrix metalloproteinases, MMPs)，因而被認(rèn)為是交叉韌帶損傷后關(guān)節(jié)腔內(nèi)微環(huán)境的主要調(diào)節(jié)者。為了進(jìn)一步更深入的探討滑膜的關(guān)節(jié)腔微環(huán)境調(diào)控作用，我們體外模擬交叉韌帶損傷后關(guān)節(jié)腔內(nèi)微環(huán)境，在細(xì)胞水平上研究力-化學(xué)因素刺激下，滑膜成纖維細(xì)胞中賴氨酰氧化酶(Lysyl oxidases, LOXs)和MMPs的表達(dá)以及MMP-2活性。本文主要研究工作及結(jié)果如下：
　?、?TNF-α和IL-1β對滑膜成纖維細(xì)胞中

3、LOXs和MMPs表達(dá)以及MMP-2活性的影響
　　炎癥因子被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)時期重要的化學(xué)調(diào)節(jié)者。研究結(jié)果顯示10ng/ml TNF-α抑制了滑膜成纖維細(xì)胞中LOXs的表達(dá)。10ng/ml IL-1β上調(diào)了LOX、LOXL-1和LOXL-3的表達(dá)，下調(diào)了LOXL-2和LOXL-4的表達(dá)。TNF-α和IL-1β分別上調(diào)了MMP-1,2,3的表達(dá)。TNF-α與IL-1β的結(jié)合不同程度地抑制了LOXs的表達(dá)，卻以協(xié)同方式大大促進(jìn)了MMP

4、-1,2,3的表達(dá)。明膠酶譜實驗指出TNF-α和IL-1β的結(jié)合進(jìn)一步以劑量和時間依賴性形式誘導(dǎo)了MMP-2活性的增加，且MMP-2活性高于TNF-α和IL-1β的單獨促進(jìn)作用。炎癥因子刺激下，滑膜成纖維細(xì)胞中表達(dá)失衡的LOXs和MMPs分泌進(jìn)入關(guān)節(jié)液，造成關(guān)節(jié)腔中交叉韌帶重塑過程的失衡，這可能是導(dǎo)致受損交叉韌帶無法愈合的一個重要原因。說明受損交叉韌帶無法愈合不僅與其自身因素有關(guān)，還與韌帶損傷后關(guān)節(jié)腔內(nèi)微環(huán)境的改變有關(guān)，其中滑膜對于關(guān)節(jié)

5、腔內(nèi)微環(huán)境的改變起著重要的調(diào)控作用。因此在研究交叉韌帶修復(fù)工作中，滑膜是不能被忽視的。
　?、趽p傷性力學(xué)拉伸作用下TNF-α對滑膜成纖維細(xì)胞中LOXs和MMPs表達(dá)以及MMP-2活性的影響
　　在正常生理環(huán)境下，力學(xué)刺激是和關(guān)節(jié)腔內(nèi)其它因子共同作用來引發(fā)損傷級聯(lián)反應(yīng)的。結(jié)果顯示12﹪損傷性力學(xué)拉伸抑制了LOXs（除LOXL-2）的表達(dá)，卻上調(diào)了MMP-1,2,3的表達(dá)。與10ng/ml的TNF-α相似，5ng/ml的TNF-

6、α仍然抑制了LOXs的表達(dá)，促進(jìn)了MMP-1,2,3的表達(dá)。在5ng/mlTNF-α存在的情況下，滑膜成纖維細(xì)胞受到損傷性力學(xué)拉伸的第1,2,3個小時里表現(xiàn)出的LOXs表達(dá)量的上調(diào)受到抑制，之后在6h時，LOXs表達(dá)量降到對照組水平以下。相反，損傷性力學(xué)拉伸與TNF-α以協(xié)同作用方式促進(jìn)了MMP-1,2,3的表達(dá)以及MMP-2的活性。此外，體外劃痕實驗顯示TNF-α抑制了細(xì)胞的遷移。在力學(xué)損傷和炎癥因子共同作用下，滑膜成纖維細(xì)胞中表達(dá)失

7、衡的LOXs和MMPs釋放入滑液中引起關(guān)節(jié)腔微環(huán)境的變化，引起受損交叉韌帶細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的失衡，不利于韌帶修復(fù)。以上結(jié)果說明除了交叉韌帶自身因素外，關(guān)節(jié)腔中微環(huán)境的改變也影響著韌帶的愈合能力。此外，研究結(jié)果還指出滑膜成纖維細(xì)胞對力學(xué)因子和炎癥因子非常敏感，并且在調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)腔微環(huán)境中起著重要作用。因此在研究交叉韌帶修復(fù)工作中，滑膜是不能被忽視的。
　?、蹞p傷性力學(xué)拉伸和TGF-β1對滑膜成纖維細(xì)胞中LOXs和MMP-1,2,3表

8、達(dá)以及MMP-2活性的影響
　　在韌帶愈合的炎癥反應(yīng)期，不僅炎癥因子（TNF-α和IL-1β）而且生長因子（如TGF-β1）也參與了韌帶的修復(fù)。結(jié)果顯示損傷性力學(xué)拉伸抑制了LOXs（除LOXL-2）的表達(dá),而TGF-β1上調(diào)了LOXs的表達(dá)。損傷性力學(xué)拉伸和TGF-β1分別上調(diào)了MMP-1,2,3的表達(dá)。損傷性力學(xué)拉伸與TGF-β1共同作用，促進(jìn)了LOXs（除LOXL-1）和MMP-1,2,3的表達(dá)，并且MMPs的上調(diào)程度大于LO

9、Xs的上調(diào)程度。此外，損傷性力學(xué)拉伸與TGF-β1結(jié)合，以時間依賴性方式大大促進(jìn)了MMP-2的活性，明顯超過了力因子單獨對MMP-2的作用。在力學(xué)損傷和生長因子共同作用下，相對于LOXs的表達(dá)水平，滑膜成纖維細(xì)胞中更高的MMPs表達(dá)和活性破壞了交叉韌帶細(xì)胞外基質(zhì)重塑過程的平衡狀態(tài)，不利于韌帶修復(fù)。以上結(jié)果除了說明交叉韌帶受損后關(guān)節(jié)腔微環(huán)境改變對韌帶愈合的不利影響外，也說明滑膜在關(guān)節(jié)腔微環(huán)境調(diào)控過程中起著重要作用，并且其作用的發(fā)揮受力因子

10、和生長因子的共同影響。因此，滑膜在韌帶愈合過程中的作用越來越重要，不能被忽視。
　　④ NF-κB信號通路介導(dǎo)了損傷性力學(xué)拉伸和TGF-β1對滑膜成纖維細(xì)胞中MMP-2活性的調(diào)節(jié)過程
　　利用信號通路抑制劑來研究損傷性力學(xué)拉伸和TGF-β1調(diào)控滑膜成纖維細(xì)胞中MMP-2表達(dá)的主要信號通路。結(jié)果顯示由于NF-κB信號通路抑制劑Bay11-7082和Bay11-7085的加入，損傷性力學(xué)拉伸和TGF-β1誘導(dǎo)的滑膜成纖維細(xì)胞中M

11、MP-2的活性被抑制。
　?、轂榱烁鎸嵉哪M體內(nèi)環(huán)境，實驗建立共培養(yǎng)體系，研究共培養(yǎng)環(huán)境下，滑膜細(xì)胞對PCL細(xì)胞中LOXs的直接性的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示相比單培養(yǎng)而言，共培養(yǎng)促進(jìn)了PCL細(xì)胞中LOXs的表達(dá)。這一結(jié)果直接表明了滑膜與PCL之間有交流，并且更加說明滑膜作為微環(huán)境調(diào)節(jié)者參與了交叉韌帶的愈合。
　　綜上所述，交叉韌帶損傷后關(guān)節(jié)腔微環(huán)境的改變可能是導(dǎo)致其自身修復(fù)失敗的重要原因，并且滑膜通過對關(guān)節(jié)腔內(nèi)微環(huán)境的調(diào)控參與了