損傷的前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶中的賴氨酰氧化酶和基質(zhì)金屬蛋白酶的研究.pdf

1、前交叉韌帶(Anterior cruciate ligament，ACL)和內(nèi)側(cè)副韌帶(Medial collateralligament，MCL)是兩個極容易受損傷的膝關(guān)節(jié)組織。損傷的內(nèi)側(cè)副韌帶具有較強的自我修復(fù)能力，即使在韌帶中部完全撕裂的情況下，在一個月的時間內(nèi)也能恢復(fù)并保留原有韌帶的功能。而損傷的前交叉韌帶自我恢復(fù)能力極弱，精心的外科手術(shù)治療也不能恢復(fù)其功能。前交叉韌帶的損傷會引起膝關(guān)節(jié)的不穩(wěn)定、膝關(guān)節(jié)疼痛，甚至還會導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)內(nèi)

2、其他組織的進一步降解和骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)的發(fā)生。
　　 韌帶損傷后的修復(fù)過程，都會伴隨損傷的細胞外基質(zhì)的降解和新的細胞外基質(zhì)的合成?；|(zhì)金屬蛋白酶家族(Matrix Metalloproteinases，MMPs)在這個降解與合成的動態(tài)平衡中起著重要的作用。與此同時，越來越多的證據(jù)表明賴氨酰氧化酶家族(Lysyl Oxidase Family，LOXs)與組織的損傷、修復(fù)有直接的聯(lián)系。賴氨酰氧化酶催

3、化膠原蛋白和彈性蛋白的賴氨酸肽殘基使其變成乙醛肽，從而引起這些不穩(wěn)定的乙醛肽之間的相互交叉連接，形成不溶的細胞外基質(zhì)蛋白網(wǎng)。賴氨酰氧化酶的這種能力，使它擔當起了細胞外基質(zhì)生成、穩(wěn)定和修復(fù)的職能。賴氨酰氧化酶家族的每個成員(LOX和LOXL-1，2，3，4)的這種促進膠原之間相互連接的縮合反應(yīng)功能，到目前為止已經(jīng)陸續(xù)得到證實。但是，賴氨酰氧化酶家族在前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶中的表達情況的研究還不為人們所知。
　　 韌帶損傷后會出現(xiàn)炎

4、癥反應(yīng)時期(Inflammatory phase)。炎癥反應(yīng)時期伴隨各種細胞因子(諸如炎癥因子TNF-α、IL-1β和生長因子TGF-β1等)的產(chǎn)生，這些細胞因子作為炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)者參與韌帶的修復(fù)。論文通過體外細胞實驗，研究賴氨酰氧化酶家族和基質(zhì)金屬蛋白酶家族的表達。本文的主要研究內(nèi)容和研究結(jié)果如下：
　　 首先，用力學拉伸模擬體內(nèi)韌帶細胞的損傷，檢測損傷后LOX家族的表達。實驗用等雙軸拉伸裝置，對ACL和MCL細胞同時施加不同程

5、度的力學刺激(6％生理拉伸組；12％損傷拉伸組)，結(jié)果顯示，力學刺激上調(diào)LOX家族的表達，且12％的力學損傷使LOX家族的表達遠高于6％的生理拉伸。6％生理拉伸時，LOX家族成員在ACL和MCL細胞中都呈上調(diào)趨勢，但LOX和LOXL-4在ACL中的表達高于MCL，LOXL-3在MCL中的表達高于ACL，而LOXL-1和LOXL-2則有一定的波動性。12％力學損傷時，LOX家族在MCL細胞中的高表達均明顯高于在ACL中的表達。
　　

6、 其次，在外源性轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1、腫瘤壞死因子TNF-α、白介素-1beta(IL-1β)作用下，考察正常ACL和MCL細胞中LOX家族的差異性表達。結(jié)果顯示，TGF-β1和IL-1β均上調(diào)LOX家族的表達，且LOX家族在MCL細胞中的表達總體上高于在ACL中的表達。TGF-β1引起LOX家族在兩種分細胞中的高表達是一個持續(xù)的過程；而IL-1β上調(diào)LOX家族則呈劑量依賴性。TNF-α抑制LOX家族在兩種細胞中的表達，且在ACL

7、細胞中的抑制效果比MCL明顯。
　　 再次，在損傷的ACL和MCL細胞中(即12%力學拉伸實現(xiàn)細胞損傷)，考察TGF-β1、TNF-α、和IL-1β作用下LOX家族的差異性表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TGF-β1和IL-1β均增強了LOX家族在損傷的ACL和MCL中的表達，且TGF-β1的作用效果強于IL-1β。TGF-β1引起損傷的ACL和MCL細胞中LOXL-1，3和4的高表達強于TGF-β1對正常細胞的刺激，而LOX和LOXL-2弱于

8、TGF-β1對正常細胞的刺激。IL-1β上調(diào)正常ACL細胞中LOX家族的表達高于損傷的ACL細胞，而損傷的MCL中IL-1β上調(diào)LOX家族遠高于正常的MCL。TNF-α促使損傷的ACL和MCL中LOX家族(LOXL-2除外)出現(xiàn)峰值后迅速下降，作用24小時后基本低于正常對照組。LOXL-2在損傷的細胞中受TNF-α刺激后一直呈下降趨勢，但弱于TNF-α對正常細胞的下調(diào)。
　　 接著，在實驗室已有研究的基礎(chǔ)上，在損傷的ACL和MC

9、L細胞中，考察MMP家族部分成員受TGF-β1、TNF-α、IL-1β作用后的差異性表達。結(jié)果顯示，三種因子都高表達MMP-1，2，3和12，且MMPs在ACL中的表達均高于在MCL中的表達。炎癥因子TNF-α和IL-1β上調(diào)了MMPs的基因表達，且TNF-α引起的上調(diào)比IL-1β高；而酶譜檢測MMP-2蛋白時，發(fā)現(xiàn)IL-1β引起的MMP-2活性帶的表達比TNF-α強。生長因子TGF-β1同樣引起MMP-1，2，3和12在損傷的ACL和

10、MCL中的高表達，且ACL中的表達均比MCL中高。
　　 接著，為了進一步模擬體內(nèi)環(huán)境，實驗用滑膜細胞和前交叉韌帶細胞實現(xiàn)共培養(yǎng)，考察共培養(yǎng)條件下，損傷的前交叉韌帶中MMP-2的蛋白表達。結(jié)果顯示，共培養(yǎng)促進MMP-2在ACL細胞中的表達，但共培養(yǎng)引起的MMP-2高表達低于單損傷條件引起的MMP-2高表達，而共培養(yǎng)下?lián)p傷的ACL中MMP-2的高表達強于共培養(yǎng)下正常ACL的表達或單培養(yǎng)下?lián)p傷ACL中的表達。
　　 最后，實

11、驗采用MMP抑制劑作用于共培養(yǎng)下?lián)p傷的前交叉韌帶細胞(或損傷的滑膜細胞)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6種抑制劑均不同程度下調(diào)MMP-2在損傷的前交叉韌帶細胞或滑膜細胞中的表達，其中以通路NF-kappa B的抑制劑Bay11-7082和AP-1的抑制劑Curcumin效果最為明顯，MMP-2的活化形式被抑制，僅存在少量MMP-2的酶原形式的表達。
　　 綜合以上研究結(jié)果，我們證實，與MCL相比，生長因子TGF-β1和炎癥因子TNF-α、IL-1

12、β均引起正常/損傷的ACL細胞表達相對較低的LOX家族，使損傷后的細胞外基質(zhì)朝著不利于修復(fù)的方面發(fā)展，我們推斷這可能是ACL不能自我修復(fù)的原因之一；同時三種因子均引起損傷的ACL中MMPs的高表達遠超過損傷的MCL，過高表達的MMPs使損傷后的細胞外基質(zhì)朝著有利于降解的方面發(fā)展，我們推斷這可能是ACL不能自我修復(fù)的另一個原因。
　　 研究LOX家族在損傷ACL和MCL中的表達，可以為臨床上韌帶創(chuàng)傷的治療提供定量的參考依據(jù)。增強L