特發(fā)性高草酸尿癥模型大鼠肝組織的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：特發(fā)性高草酸尿癥大鼠模型肝組織二維電泳的可行性評價
　　 目的：在正式進(jìn)行DIGE實(shí)驗(yàn)前，需要進(jìn)行二維電泳的可行性評價，并測試樣品的標(biāo)記可行性，為熒光差異顯示凝膠電泳實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法：選擇3只24小時尿草酸排泄量較高的特發(fā)性高草酸尿癥模型大鼠作為實(shí)驗(yàn)組，選擇3只24小時尿草酸排泄量在正常范圍的SD大鼠作為對照組，切取其肝臟組織后分別提取總蛋白，然后利用雙

2、向電泳技術(shù)分離蛋白，掃描后獲得二維電泳的圖譜，并對提取的蛋白樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)果：總共獲得6張穩(wěn)定清晰的二維電泳圖譜和1張SDS-PAGE熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)電泳圖譜。
　　 結(jié)論：由上述6張二維電泳圖譜來看,六個蛋白質(zhì)樣品的蛋白質(zhì)點(diǎn)的遷移基本穩(wěn)定正常，且各個蛋白提取液與DIGE熒光染料是兼容的，從而保證后續(xù)正式的DIGE實(shí)驗(yàn)有較好的重復(fù)穩(wěn)定性和可行性。
　　 第二部分：特發(fā)性高草酸尿癥大鼠模型肝組織熒光差

3、異顯示雙向凝膠電泳
　　 目的：建立穩(wěn)定的特發(fā)性高草酸尿癥大鼠肝組織蛋白質(zhì)組的熒光差異顯示雙向凝膠電泳圖譜，并對其進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組的分析。
　　 方法：取特發(fā)性高草酸尿大鼠及正常對照大鼠的肝組織300mg，勻漿提取肝組織總蛋白，分別用Cy3或Cy5標(biāo)記，每一對Cy3和Cy5標(biāo)記樣品都與一個Cy2標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)等量混合，采用熒光差異顯示凝膠電泳（DIGE）技術(shù)進(jìn)行電泳分離，經(jīng)過不同激光下掃描得到不同樣品的蛋白質(zhì)組圖譜。獲得的圖

4、譜經(jīng)DeCyderTM v6.5軟件進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：在特發(fā)性高草酸尿癥大鼠肝組織中共篩選出21個差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，有11個蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著增加，另外10個蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著下降。
　　 結(jié)論：利用DIGE技術(shù)可以作膠內(nèi)對比分析，并可根據(jù)內(nèi)標(biāo)消除膠與膠之間的差異，從而提高統(tǒng)計(jì)可信度。分析出的21個差異蛋白質(zhì)可能與特發(fā)性高草酸尿癥的發(fā)生有密切關(guān)系。
　　 第三部分：特發(fā)性高草酸尿癥大鼠模型肝組織差異表達(dá)蛋白

5、質(zhì)的質(zhì)譜鑒定
　　 目的：利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF-MS）對特發(fā)性高草酸尿癥大鼠模型肝組織差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析和鑒定。
　　 方法：將熒光標(biāo)記的雙向凝膠電泳凝膠圖與制備膠進(jìn)行匹配后，在考染凝膠上找到相應(yīng)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，選定要切的蛋白質(zhì)點(diǎn)，經(jīng)自動蛋白質(zhì)點(diǎn)切割機(jī)切取，酶解后，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF-MS）對差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定，獲取PMF(p

6、eptidemass fingerprint)指紋圖譜,并在NCBI nr 20060526蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行蛋白質(zhì)匹配。
　　 結(jié)果：采用MALDI-TOF-MS質(zhì)譜技術(shù)共對21個差異蛋白進(jìn)行了鑒定，其中18個點(diǎn)找到與 PMF圖匹配的蛋白質(zhì)。有一個下調(diào)蛋白質(zhì)點(diǎn)689有PMF圖，但未在蛋白質(zhì)庫中找到與之相匹配的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)包括蛋白二硫化物異構(gòu)酶A3（Pdia3）、乙醛脫氫酶（mitochondrial aldehyde d

7、ehydrogenase，ALDH）、rCG27878、兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶雙底物抑制復(fù)合體A鏈（Chain A，Catechol O-Methyltransferase Bisubstrate-Inhibitor Complex）等。
　　 結(jié)論：通過質(zhì)譜鑒定篩選出的這些差異蛋白質(zhì)可能參與了特發(fā)性高草酸尿癥的發(fā)生。在后期研究中，擬采用western 技術(shù)對特發(fā)性高草酸尿癥中這些差異蛋白進(jìn)行檢測，而對未知蛋白的深入研究，也將有