膽道閉鎖和特發(fā)性膽汗淤積癥肝臟組織差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、膽道閉鎖及特發(fā)性膽汁淤積癥均為新生兒期較為常見的肝膽系統(tǒng)疾病，其臨床癥狀有許多共同之處，如黃疸均在新生兒及嬰兒期出現(xiàn)，糞便均呈現(xiàn)淡黃色或白色，均存在肝臟增大及質(zhì)地變硬；血液生化檢查都存在高結(jié)合膽紅素血癥及酶學(xué)異常，以谷丙轉(zhuǎn)氨酶、γ-GT等升高為主：另外，病理改變表現(xiàn)亦相似，均為肝細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)膽汁淤積，匯管區(qū)炎性浸潤(rùn)、肝細(xì)胞變性壞死等，這些特征為臨床診斷及鑒別診斷帶來了很大困難。由于兩種疾病的治療方式及預(yù)后有顯著差異，膽道閉鎖需限期外

2、科手術(shù)治療，而新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥一般采取內(nèi)科處理，因此，臨床上迫切需要對(duì)這兩種疾病進(jìn)行謹(jǐn)慎鑒別。膽道閉鎖發(fā)病機(jī)制未明，在病毒感染、免疫反應(yīng)、發(fā)育異常及遺傳因子等的參與下，發(fā)病過程涉及復(fù)雜的基因間和/或蛋白質(zhì)問的相互作用，細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)和環(huán)境的影響也會(huì)通過影響基因的表達(dá)及蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄后加工。本研究采用雙向電泳及相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記(iTRAQ)技術(shù)對(duì)膽道閉鎖及新生兒肝內(nèi)膽汁淤積癥患者肝臟組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)譜差異的分析，從

3、而篩選出差異蛋白，并對(duì)其中差異分子熱休克蛋白90(HSP90)的差異表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，試圖從蛋白質(zhì)組學(xué)的研究角度對(duì)膽道閉鎖發(fā)生機(jī)制及鑒別診斷提供線索。
　　 第一部分雙向電泳質(zhì)譜技術(shù)對(duì)膽道閉鎖與特發(fā)性膽汁郁積癥肝組織的差異蛋白研究
　　 目的
　　 本研究分別選擇膽道閉鎖與特發(fā)性膽汁淤積癥肝組織，從蛋白質(zhì)層面入手，以雙向凝膠電泳的方法對(duì)這兩種疾病表達(dá)差異的蛋白進(jìn)行篩選，并對(duì)其中的HSP90的定量表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，試圖為疾

4、病發(fā)生機(jī)制及鑒別診斷提供線索。
　　 材料與方法
　　 選取因梗阻性黃疸行腹腔鏡下膽道造影術(shù)的患兒術(shù)中肝臟組織，術(shù)中明確診斷膽道閉鎖者20例作為病例組，排除膽道閉鎖者12例作為對(duì)照組，病例組內(nèi)再分為2組各10例進(jìn)行組內(nèi)對(duì)照。提取肝臟組織總蛋白后組內(nèi)蛋白等量混合，應(yīng)用非線性PH3～10，長(zhǎng)24cm的固定PH梯度的IPG膠條和12％的SDS-PAGE進(jìn)行雙向凝膠電泳分離總蛋白，考馬斯亮藍(lán)染色后用ImageScanner軟件對(duì)

5、凝膠進(jìn)行掃描，PDquest8.0軟件對(duì)兩組的全蛋白質(zhì)組表達(dá)譜進(jìn)行差異分析，篩選兩組間表達(dá)差異2倍以上的蛋白點(diǎn)。對(duì)膠中差異較大的18個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析，數(shù)據(jù)送入NCBI非冗余數(shù)據(jù)庫(kù)，通過MASCOT搜索引擎檢索。另選取了兩組各13例患兒的肝臟組織，利用Western-Blot法對(duì)熱休克蛋白90(HSP90)差異表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 結(jié)果
　　 1、在60個(gè)差異點(diǎn)中差異較大、在膠上顯示清晰且與周圍蛋白點(diǎn)

6、分離較好的18個(gè)點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF質(zhì)譜分析，鑒定出15個(gè)蛋白點(diǎn)，其中9個(gè)蛋白點(diǎn)在病例組中上調(diào)，包括肌球蛋白、RhoGDI、MnSOD、白蛋白、鈣網(wǎng)蛋白以及波形蛋白；同時(shí)，6個(gè)蛋白點(diǎn)在對(duì)照組中上調(diào)，包括熱休克蛋白、蛋白二硫鍵異構(gòu)酶、氨甲酰磷酸合成酶以及膜粘連蛋白。
　　 2、Westen blot檢測(cè)病例組及對(duì)照組各13例患者肝組織中HSP90的表達(dá)，經(jīng)Quantity One軟件分析比較掃描圖像的灰度值，病例組灰度平均值為

7、53279±12288，對(duì)照組灰度平均值為276669±70025，P=0.03<0.05。
　　 結(jié)論
　　 雙向凝膠電泳質(zhì)譜發(fā)現(xiàn)肝組織內(nèi)數(shù)種在膽道閉鎖與膽汁淤積癥之間差異表達(dá)的蛋白，這些差異蛋白可能與膽道閉鎖及膽汁淤積癥的發(fā)病、進(jìn)展及臨床轉(zhuǎn)歸有關(guān)，為探索膽道閉鎖與膽汁淤積癥的發(fā)病機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)：HSP90定量結(jié)果顯著升高，具有成為鑒別膽道閉鎖與特發(fā)性膽汁淤積癥的生物標(biāo)志物之潛在價(jià)值。
　　 第二部分

8、 ITRAQ技術(shù)對(duì)膽道閉鎖與特發(fā)性膽汁淤積癥肝組織的差異蛋白研究
　　 目的
　　 本研究采用iTRAQ技術(shù)對(duì)以上相同組織標(biāo)本差異蛋白進(jìn)行檢測(cè)，以求獲得更廣的差異蛋白表達(dá)譜，研究相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記(iTRAQ)技術(shù)檢測(cè)膽道閉鎖與特發(fā)性膽汁郁積癥肝組織的差異蛋白，為后續(xù)疾病發(fā)生機(jī)制及早期診斷、鑒別診斷等提供進(jìn)一步研究線索。
　　 材料和方法
　　 肝組織樣本來源同第一部分。在本部分研究中我們將對(duì)照組病

9、例同樣隨機(jī)分為兩組，即所有樣本共分為病例組1、病例組2、對(duì)照組1和對(duì)照組2四組。病例組每組10例，對(duì)照組每組6例。采用iTRAQ定量技術(shù)聯(lián)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(Liguid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)技術(shù)，對(duì)兩組患者的肝臟組織進(jìn)行比較比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究。MS/MS數(shù)據(jù)采用Protein Pilot3.0軟件進(jìn)行肽段及蛋白質(zhì)的鑒定及差異表達(dá)的定量搜庫(kù)，鑒定蛋白所采用的置

10、信區(qū)間大于95％，滿足EF(error factor)<2，且P<0.05的條件，鑒定的蛋白具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鑒定到的蛋白質(zhì)的定量結(jié)果經(jīng)the Pro GroupTM Algorithm(AppliedBiosystems)算法處理。組間表達(dá)差異大于20％即>1.2倍或<0.8倍即被認(rèn)為該蛋白質(zhì)表達(dá)存在差異。
　　 結(jié)果
　　 1、數(shù)據(jù)經(jīng)搜庫(kù)及數(shù)據(jù)處理后，共鑒定出iTRAQ標(biāo)記定量信息的蛋白593個(gè)。設(shè)定差異蛋白的入選條件

11、為通過同一蛋白在各組間表達(dá)量的比值，得到該蛋白在4組中表達(dá)量的相對(duì)值，并計(jì)算出在病例組和對(duì)照組組內(nèi)表達(dá)平均值，將兩組平均值相比后排序，選出比值最高和最低的蛋白分別25個(gè)，并排除其中組內(nèi)差異>組間差異的點(diǎn)，這樣篩選出的蛋白共38個(gè)，其中21個(gè)在病例組上調(diào)，分別為SERPH、LV301、LV403、TBB2C、SSBP、DPYL2、RL7、PRDX5、ECHD2、THTM、KAD2、COMT、H2A2C、ACOT2、SRSF3、H15、IF

12、4B、H2AZ、HNRPM、MYH9以及THIM；17個(gè)在對(duì)照組上調(diào)，分別為PRDX1、HMCS2、TCPD、HBD、GATM、THIK、FUCM、COF1、ACBP、GSTA2、CK054、HCDH、EST1、PRDX6、TPIS、RLA2以及ASSY。
　　 2、通過于雙向電泳法的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白90、膜聯(lián)蛋白A6、蛋白二硫鍵異構(gòu)酶及肌球蛋白4個(gè)蛋白也在iTRAQ檢測(cè)中被鑒定出來，且在兩組病人中兩種方法檢測(cè)出的表達(dá)趨勢(shì)一