土元提取物對(duì)脂多糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶表達(dá)的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的:探討土元提取物（extract of Eupolyphaga）對(duì)脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbillica VeinEndothelial Cells，HUVEC)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxidesynthase，eNOS)及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

2、。
　　方法:
　　1.土元提取物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響
　　1.1 血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)購(gòu)買人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVEC)常規(guī)復(fù)蘇，培養(yǎng)，傳代。
　　1.2 土元提取物對(duì)體外培養(yǎng)HUVEC增殖功能的影響土元提取物濃度梯度設(shè)定為0.0625mg/ml、0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、4.0mg/ml，作用時(shí)間為24h; MTT法測(cè)定各孔的存活率，以

3、OD值表示。
　　1.3 土元提取物對(duì)脂多糖(LPS)作用后的HUVEC增殖活性的影響實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(control)，LPS干預(yù)組（LPS100μg/ml作用12h），LPS加不同濃度土元提取物組(0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0mg/ml土元提取物作用24h加LPS100μg/ml作用12h)，MTT法測(cè)定各孔的OD值。
　　2.土元提取物對(duì)LPS干預(yù)后的HUVEC培養(yǎng)基上清中一氧化

4、氮(NO)、丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(control)，LPS干預(yù)組(LPS100μg/ml作用12h)，LPS加不同濃度土元提取物組（0.25、0.5、1.0mg/ml土元提取物作用24h加LPS100μg/ml作用12h），采用NO、SOD、MDA測(cè)定試劑盒測(cè)定各組HUVEC培養(yǎng)基上清中NO、SOD、MDA含量，檢測(cè)其對(duì)HUVEC培養(yǎng)基上清中NO、MDA含量及SOD活力的影響。

5、>　　3.HUVEC被LPS干預(yù)不同時(shí)間后其eNOS、iNOS蛋白表達(dá)比較實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(control)，LPS100μg/ml不同時(shí)間干預(yù)組，作用時(shí)間分別為4h、8h、12h、16h、24h。RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，Western blot法檢測(cè)各組eNOS、iNOS蛋白表達(dá)水平。
　　4.不同濃度土元提取物對(duì)LPS干預(yù)后的HUVEC其eNOS、iNOS蛋白表達(dá)比較實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組，LPS100μg/ml干預(yù)12h

6、組，LPS加不同濃度土元提取物組(0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml土元提取物作用24h加LPS100μg/ml作用12h)，RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，Western blot法檢測(cè)各組eNOS、iNOS蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.土元提取物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響
　　1.1 HUVEC形態(tài)觀察倒置相差顯微鏡下，細(xì)胞株復(fù)蘇培養(yǎng)約0.5h既有細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，未貼壁的為小球形，呈懸浮狀態(tài)，剛

7、貼壁的細(xì)胞呈圓形，單個(gè)或聚集成團(tuán)，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切位蛩笮?，繼續(xù)培養(yǎng)可見大部分細(xì)胞貼壁、伸展，3d后細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸密集，細(xì)胞間相互連接，呈多邊形、梭形等，邊界清楚，排列較疏松，胞漿豐富，可見圓形或橢圓形細(xì)胞核，常有1-2個(gè)核仁。培養(yǎng)8d后，細(xì)胞相互之間聯(lián)系密切，融合成連續(xù)的單層細(xì)胞，分界較為模糊，外觀呈特征性的鵝卵石樣形態(tài)。
　　1.2 土元提取物對(duì)HUVEC增殖功能的影響土元提取物在0.0625-4.0mg/ml濃度之間可促進(jìn)HUV

8、EC增殖(P＜0.01)，在4.0mg/ml濃度時(shí)OD值較2.0mg/ml濃度顯著降低(P＜0.01)，提示土元提取物濃度大于4.0mg/ml時(shí)，對(duì)HUVEC的促增殖功能下降。
　　1.3 土元提取物對(duì)LPS干預(yù)后的HUVEC增殖活性的影響LPS干預(yù)組(LPS100μg/ml作用12h)對(duì)比空白對(duì)照組OD值顯著降低(P＜0.01)，LPS干預(yù)組使HUVEC增殖活性下降。LPS加不同濃度土元提取物組(0.0625mg/ml、0.12

9、5mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、4.0mg/ml土元提取物作用24h加LPS100μg/ml作用12h)對(duì)比LPS干預(yù)組OD值顯著增高(P＜0.01)，土元提取物在此濃度區(qū)間可以改善HUVEC因LPS作用而降低的增殖活性。
　　1.4 土元提取物作用濃度確定土元提取物濃度設(shè)置為0.0625mg/ml、0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml

10、、2.0mg/ml、4.0mg/ml，根據(jù)MTT結(jié)果分析確定土元提取物的作用濃度為0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml。
　　2.土元提取物對(duì)LPS干預(yù)后的HUVEC培養(yǎng)基上清中NO、MDA含量及SOD活力的影響
　　2.1 NO含量的影響與空白對(duì)照組比較，LPS干預(yù)組(LPS100μg/ml作用12h)中NO含量明顯增加(P＜0.01)，LPS加不同濃度土元提取物組（0.25、0.5、1.0mg/ml的土

11、元提取物作用24h加LPS100μH/ml作用12h）對(duì)比LPS干預(yù)組NO含量均顯著降低(P＜0.01)，且隨著濃度的增加NO含量明顯降低(P＜0.05)。
　　2.2 SOD活力的影響與空白對(duì)照組比較，LPS干預(yù)組（LPS100μg/ml作用12h）中SOD活力明顯降低(P＜0.01)，LPS加不同濃度土元提取物組(0.25、0.5、1.0mg/ml土元提取物作用24h加LPS100μg/ml作用12h)對(duì)比LPS干預(yù)組SOD活

12、力均顯著增加(P＜0.01)，且隨著濃度的增加SOD活力明顯增加(P＜0.05)。
　　2.3 MDA含量的影響與空白對(duì)照組比較，LPS干預(yù)組(LPS100μg/ml作用12h)中MDA含量明顯增加（P＜0.01），LPS加不同濃度土元提取物組(0.25、0.5、1.0mg/ml土元提取物作用24h加LPS100μg/ml作用12h)對(duì)比LPS干預(yù)組MDA含量均顯著降低(P＜0.01)，隨著濃度增加MDA含量降低不顯著(P＞0.0

13、5)。
　　3.HUVEC被LPS干預(yù)不同時(shí)間后其eNOS、iNOS蛋白表達(dá)比較與空白對(duì)照組比較，給予LPS刺激4h、8h、12h、16h、24h，HUVEC中eNOS、iNOS蛋白表達(dá)隨時(shí)間增加而增加(P＜0.01)，在12h時(shí)達(dá)最大值后逐漸下降。
　　4.LPS作用時(shí)間確定LPS作用時(shí)間設(shè)定為4h、8h、12h、16h、24h，根據(jù)Western blot結(jié)果選取LPS作用時(shí)間為12h。
　　5.不同濃度土元提取物

14、對(duì)LPS干預(yù)后的HUVEC其eNOS、iNOS蛋白表達(dá)比較
　　5.1 eNOS蛋白表達(dá)比較與空白對(duì)照組比較，LPS干預(yù)組（LPS100μg/ml作用12h）中eNOS蛋白表達(dá)含量明顯增高(P＜0.01)，LPS加不同濃度土元提取物組(0.25、0.5、1.0mg/ml土元提取物作用24h加LPS100μg/ml作用12h)對(duì)比LPS干預(yù)組eNOS蛋白表達(dá)均顯著降低(P＜0.01)，且隨著濃度增加的eNOS蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0

15、.05)。
　　5.2 iNOS蛋白表達(dá)比較與空白對(duì)照組比較，LPS干預(yù)組(LPS100μg/ml作用12h)中iNOS蛋白表達(dá)含量明顯增高（P＜0.01），LPS加不同濃度土元提取物組(0.25、0.5、1.0mg/ml土元提取物作用24h加LPS100μg/ml作用12h)對(duì)比LPS干預(yù)組iNOS蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.01），且隨著濃度增加的iNOS蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.土元

16、提取物(0.0625-4.0 mg/ml)可顯著促進(jìn)HUVEC的增殖，并可以改善LPS作用導(dǎo)致的HUVEC增殖降低，其中1.0、2.0 mg/ml作用最顯著（此兩劑量作用無(wú)差異）。
　　2.LPS作用于HUVEC，其培養(yǎng)基上清中NO、MDA含量升高、SOD活力降低，土元提取物可以降低因LPS作用而升高的NO、MDA含量、升高因LPS作用而降低的SOD活力。
　　3.土元提取物可以下調(diào)因LPS作用而升高的eNOS、iNOS蛋白