高分子避孕復(fù)合材料在哺乳動物體內(nèi)外遺傳毒性檢測.pdf

1、第一部分，高分子避孕復(fù)合材料體外遺傳毒性的檢測—小鼠淋巴瘤細(xì)胞突變實驗及彗星實驗
　　目的：檢測高分子避孕復(fù)合材料和金屬銅在體外對哺乳動物細(xì)胞致遺傳毒性的作用,評價該材料的安全性。
　　方法：采用小鼠淋巴瘤實驗(Mouse Lymphoma Assay,MLA)和彗星實驗即單細(xì)胞凝膠電泳實驗(SCGE)檢測各材料組對tk基因致突變能力和導(dǎo)致單個細(xì)胞DNA損傷程度。各材料RMPI-1640浸提液經(jīng)火焰原子吸收分光光度法測定銅離

2、子濃度,預(yù)實驗后選擇金屬銅組50％、25%、12.5%浸提液濃度,含銅復(fù)合材料組100%、50%、25%浸提液濃度,無銅復(fù)合材料組100%、50%、25%浸提液濃度分別測定致突變能力和DNA損傷程度,溶劑對照作為陰性對照,小鼠淋巴瘤實驗中在有無S9mix時分別選擇環(huán)磷酰胺和甲磺酸甲酯作為陽性對照。小鼠淋巴瘤實驗通過計數(shù)處理當(dāng)天平板、表達(dá)后平板和TFT拮抗平板的集落數(shù)測定PE0、PE2和MF。彗星實驗以TailDNA%和Olive尾距評價

3、細(xì)胞DNA損傷程度。
　　結(jié)果：在含有銅離子的浸提液中,細(xì)胞均出現(xiàn)了不同程度的突變,突變頻率較陰性對照組有明顯升高,其中金屬銅50%、25%和含銅復(fù)合材料組100%組可以致遺傳毒性,含銅復(fù)合材料50%組為可疑致遺傳毒性。彗星實驗結(jié)果表明,各含銅復(fù)合材料組和金屬銅組均可導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷,TailDNA%和OTM與陰性對照組相比有顯著性差異,損傷程度與浸提液中銅離子濃度有一定關(guān)系。無銅復(fù)合材料在各濃度下突變頻率、TailDNA%和O

4、TM均無明顯增高
　　結(jié)論：含銅復(fù)合材料、金屬銅組由于銅離子的存在體外可以致DNA損傷和細(xì)胞突變,具有一定的體外遺傳毒性。損傷程度與銅離子濃度存在劑量反應(yīng)關(guān)系。
　　第二部分，高分子避孕復(fù)合材料體內(nèi)遺傳毒性的檢測—小鼠骨髓微核實驗
　　目的：研究高分子避孕復(fù)合材料和金屬銅哺乳動物體內(nèi)致遺傳毒性的能力。
　　方法：KM小鼠(體重:25-30g)作為實驗動物,各材料組生理鹽水浸提,火焰原子吸收分光光度法測定銅離子濃度

5、,選擇金屬銅組50%、25%、12.5%浸提液濃度,含銅復(fù)合材料組100%、50%、25%浸提液濃度,無銅復(fù)合材料組100%、50%、25%浸提液濃度,陽性對照選擇環(huán)磷酰胺,濃度為40mg/kg體重,陰性對照為生理鹽水。各組浸提液按照1.5ml/100g體重腹腔注射染毒動物,24小時后頸椎脫臼處死動物,胸骨骨髓涂片Giemsa染色計數(shù)含微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)量評定各材料體內(nèi)遺傳毒性。
　　結(jié)果：染毒24小時胸骨骨髓微核計數(shù)結(jié)果顯示,

6、無銅材料組各染毒濃度下微核數(shù)量無明顯增加。含銅復(fù)合材料組100%、50%和25%組微核數(shù)目(每1000PCE)分別為16.0、14.6和13.4,金屬銅組50%、25%和12.5%分別為11.1、14.1和12.1。與陰性對照組相比均有顯著性差異(P<0.05),但各組微核數(shù)量與染毒濃度并未表現(xiàn)出明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系。
　　結(jié)論：含銅復(fù)合材料和金屬銅組微核數(shù)目與陰性對照組相比均有顯著性差異,但并未表現(xiàn)出明顯的劑量反應(yīng)關(guān)系,按照OEC

7、D474指導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn),尚不能確定此兩組材料具有體內(nèi)遺傳毒性。無銅材料組無體內(nèi)遺傳毒性。
　　第三部分，銅離子體外致遺傳毒性的自身修復(fù)研究以及損傷與ROS關(guān)系
　　目的：檢測體外含銅復(fù)合材料浸提液處理細(xì)胞后,去除處理物細(xì)胞DNA損傷修復(fù)情況。
　　方法：用含銅復(fù)合材料50%和25%浸提液濃度處理小鼠淋巴瘤細(xì)胞3小時,溶劑作為陰性對照。處理后取部分細(xì)胞采用彗星實驗檢測細(xì)胞DNA損傷程度,其余細(xì)胞在去除處理物后繼續(xù)培養(yǎng)3小時,同

8、樣采用彗星實驗測定細(xì)胞DNA損傷程度。彗星實驗結(jié)果經(jīng)CASP軟件分析后,TailDNA%、OTM作為DNA損傷觀測指標(biāo)。含銅復(fù)合材料25%浸提液處理后以及繼續(xù)培養(yǎng)3小時后檢測細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強度,ImageProPlus分析其平均熒光強度。
　　結(jié)果：細(xì)胞經(jīng)兩個不同含銅復(fù)合材料浸提液濃度處理3小時后,細(xì)胞DNA受損,繼續(xù)培養(yǎng)3小時后,彗星實驗結(jié)果表明,細(xì)胞受損程度較處理后有所增加,TailDNA%和OTM與處理后相比有顯著性差異(

9、P<0.05),但繼續(xù)培養(yǎng)3小時后細(xì)胞間DNA損傷程度差異增大,表明受損少的細(xì)胞得到一定的修復(fù)。細(xì)胞內(nèi)ROS含量在處理后和繼續(xù)培養(yǎng)3小時平均熒光強度與陰性對照組相比有明顯升高,分別為79.84、86.29和49.74。
　　結(jié)論：細(xì)胞經(jīng)處理后胞內(nèi)ROS含量較處理前明顯增高并持續(xù)存在,繼續(xù)培養(yǎng)后由于細(xì)胞內(nèi)ROS的升高可以使細(xì)胞DNA繼續(xù)受損。損傷修復(fù)不明顯。
　　第四部分，銅離子體內(nèi)致遺傳毒性的自身修復(fù)以及體內(nèi)SOD變化

10、>　　目的：機體對高濃度銅離子染毒造成DNA損傷修復(fù)能力檢測,以及與血漿SOD含量的關(guān)系。
　　方法：用金屬銅100%浸提液連續(xù)7天按1.5ml/100g體重腹腔注射染毒小鼠,分別在染毒前以及每次染毒后24小時斷尾取血,全血細(xì)胞進(jìn)行彗星實驗檢測血細(xì)胞DNA損傷程度,血漿用WST法測定超氧化物歧化酶活力。彗星實驗結(jié)果經(jīng)CASP軟件分析后,TailDNA%、OTM作為DNA損傷觀測指標(biāo)。
　　結(jié)果：金屬銅100%浸提液濃度染毒連

11、續(xù)染毒小鼠7天彗星實驗結(jié)果顯示,雌性小鼠于染毒后第2、3、4天DNA損傷程度最嚴(yán)重(TailDNA%為分別為55.41%、51.05%和51.99%),雄性小鼠于染毒后第4天DNA損傷最嚴(yán)重(57.20%)。雌性第小鼠第5天DNA損傷有明顯降低(18.91%),雄性小鼠第6天明顯降低(30.89%)。第7天雌雄小鼠血細(xì)胞TailDNA%分別為11.25%和10.81%。WST法測定血漿內(nèi)SOD含量表明,雄性小鼠體內(nèi)SOD含量于第4天和第