兩種新型避孕材料遺傳毒性的研究.pdf

1、第一部分 新型含銅避孕材料與含銅宮內(nèi)節(jié)育器(HCu280)細(xì)胞毒性與遺傳毒性的對比研究
　　 考察新型絡(luò)合銅納米高分子復(fù)合材料的細(xì)胞毒性與遺傳毒性，同時鑒于銅離子的抗生育作用，將市售含銅宮內(nèi)節(jié)育器（HCu280）上銅絲的細(xì)胞毒性與遺傳毒性與該新型材料進(jìn)行對比研究，從而為該材料在臨床的應(yīng)用提供可靠的信息。
　　 實驗一 絡(luò)合銅納米高分子復(fù)合材料與HCu280體外細(xì)胞毒性試驗比較（MTT比色法）
　　 目的：通過比較

2、絡(luò)合銅納米高分子復(fù)合材料與取自含銅宮內(nèi)節(jié)育器（HCu280）上的銅絲進(jìn)行體外細(xì)胞毒性的比較，為后續(xù)進(jìn)行的遺傳毒性試驗選擇合適的濃度。
　　 方法：采用MTT比色試驗檢測這兩種材料不同濃度浸提液染毒24小時對TM4細(xì)胞活率的影響。經(jīng)火焰法原子吸收光譜儀檢測銅離子的濃度，評價絡(luò)合銅納米高分子復(fù)合材料3個濃度[100％(8.54μg/ml)，50％(4.27μg/ml)，25％(2.135μg/ml)]浸提液樣品。鑒于銅離子的濃度，將

3、含銅宮內(nèi)節(jié)育器上銅絲的浸提液用完全培養(yǎng)基依次倍比稀釋為7個濃度[100％(106.54μg/ml)，50％(53.27μg/ml)，25％(26.64μg/ml)，12.5％ (13.32μg/ml)，6.25％(6.66μg/ml)，3.125％(3.33μg/ml)，1.5625％ (1.67μg/ml)]樣品。染毒后，在酶標(biāo)儀492nm波長處檢測各樣品吸光度值，得出細(xì)胞相對增殖度，根據(jù)細(xì)胞毒性評定六級反應(yīng)評定材料的毒性程度。

4、>　　 結(jié)果：新型絡(luò)合銅納米高分子復(fù)合材料不同濃度浸提液樣品的細(xì)胞相對增殖度在87.3％-92.1％范圍，細(xì)胞毒性評定為1級；HCu280組的7個濃度樣品呈現(xiàn)濃度-效應(yīng)關(guān)系，浸提原液細(xì)胞毒性過大，細(xì)胞相對增殖度接近0，對應(yīng)的毒性程度為5級，50％，25％，12.5％銅絲樣品組所對應(yīng)的相對增殖度分別為5.76％，27.58％，47.8％，體外細(xì)胞毒性試驗評定不合格。而6.25％，3.125％，1.5625％三個樣品組所對應(yīng)的細(xì)胞毒性反應(yīng)

5、為1級。
　　 結(jié)論：新型絡(luò)合銅納米高分子材料不同濃度浸提液對TM4細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性，符合ISO10993-5:2009和GB/T16886.5-2003規(guī)定關(guān)于生物材料體外細(xì)胞毒性試驗評價的要求。因此，將選取該新型材料組3個濃度樣品（100％，50％，25％）進(jìn)行彗星試驗以檢測其潛在的遺傳毒性。銅離子所致細(xì)胞毒性依賴于銅離子濃度。含銅宮內(nèi)節(jié)育器（HCu280）浸提液標(biāo)本選取6.25％，3.125％，1.5625％進(jìn)行DNA損

6、傷的檢測。
　　 實驗二 絡(luò)合銅納米高分子復(fù)合材料與HCu280體外遺傳毒性的比較（彗星試驗）
　　 目的：考察比較新型絡(luò)合銅納米高分子復(fù)合材料與銅絲對TM4細(xì)胞DNA斷裂的影響。
　　 方法：基于MTT試驗的結(jié)果，將新型絡(luò)合銅納米高分子復(fù)合材料不同濃度浸提液[100％(8.54μg/ml)，50％(4.27μg/ml)，25％(2.135μg/ml)]以及含銅宮內(nèi)節(jié)育器銅絲浸提液3個無明顯細(xì)胞毒性的樣品[6.2

7、5％(6.66μg/ml)，3.125％(3.33μg/ml)，1.5625％(1.67μg/ml)]作用于TM4細(xì)胞，24小時后各樣品組進(jìn)行臺盼藍(lán)排斥試驗，以確認(rèn)各樣品對TM4細(xì)胞活率的影響。通過彗星試驗檢測各樣品對DNA損傷的作用。以O(shè)live尾距作為評價DNA損傷的參數(shù)。
　　 結(jié)果：臺盼藍(lán)排斥試驗顯示各樣品組染毒24小時后細(xì)胞活率均大于90％。彗星試驗結(jié)果顯示，陰性對照組Olive尾距為0.87±0.22，而陽性對照組為

8、13.78±2.21，約為陰性對照組的16倍；新型絡(luò)合銅高分子復(fù)合材料3個濃度的樣品均導(dǎo)致了DNA損傷（P<0.05），并呈現(xiàn)濃度-效應(yīng)關(guān)系。其中浸提原液組Olive尾距約為陰性對照組10倍。含銅宮內(nèi)節(jié)育器銅絲浸提液3個濃度中，6.25％(6.66μg/ml)，3.125％(3.33μg/ml)兩個濃度誘發(fā)了DNA斷裂，且與陰性對照組相比有顯著性差異（P<0.05），而1.5625％(1.67μg/ml)濃度組Olive尾距與陰性對照組

9、相比無顯著性差異（P>0.05）。
　　 結(jié)論：新型絡(luò)合銅納米高分子復(fù)合材料3個濃度的樣品在沒有影響細(xì)胞活率的情況下導(dǎo)致了遺傳毒性，而銅絲浸提液樣品也導(dǎo)致了DNA損傷?？紤]到彗星試驗中各浸提液樣品中銅離子的濃度以及MTT試驗結(jié)果，我們推測新型材料所產(chǎn)生的遺傳毒性可能與銅離子有關(guān)。
　　 實驗三 絡(luò)合銅納米高分子復(fù)合材料與HCu280體外遺傳毒性的比較（Ames試驗）
　　 目的：進(jìn)一步考察并比較新型絡(luò)合銅納米高分

10、子復(fù)合材料與含銅宮內(nèi)節(jié)育器HCu280銅絲浸提液的遺傳毒性。
　　 方法：用模擬體液浸提兩種材料，經(jīng)火焰法原子吸收光譜儀測得新型材料與含銅宮內(nèi)節(jié)育器銅絲浸提原液中銅離子濃度分別為6.84μg/ml，197.0μg/ml。將新型材料浸提液用模擬體液依次倍比稀釋為100％(6.84μg/ml)，50％(3.42μg/ml)，25％(1.71μg/ml)和12.5％(0.855μg/ml)四個濃度。鑒于MTT試驗與彗星試驗結(jié)果，將含銅

11、宮內(nèi)節(jié)育器銅絲材料浸提原液（197.0μg/ml）稀釋至6.84μg/ml，以此為最高濃度，依次用模擬體液稀釋為濃度2（3.42μg/ml），濃度3（1.71μg/ml），濃度4（0.855μg/ml）四個濃度。采用Ames試驗標(biāo)準(zhǔn)平板摻入法，用TA98和TA100兩種菌株，在加與不加代謝活化系統(tǒng)大鼠肝微粒體酶（S9）的情況下檢測各樣品的致突變效應(yīng)。以突變率（MR值）評定結(jié)果的參數(shù)。
　　 結(jié)果：在不加S9時，溶劑對照組自發(fā)回變

12、菌落數(shù)TA98為21.5±0.5，TA100為174.25±1.5；加入S9時，TA98為19.5±0.25，TA100為145.2±1.2。陽性對照組在加與不加S9時，突變菌落數(shù)明顯增高，說明該試驗具可行性。在加與不加S9時，新型材料25％-100％樣品組在TA98菌株的誘發(fā)突變菌落數(shù)超過了溶劑對照組的兩倍（MR>2），并呈現(xiàn)濃度-效應(yīng)關(guān)系，提示這些樣品可誘發(fā)移碼型突變。對TA100菌株，與溶劑對照組相比，50％與100％樣品組誘發(fā)的

13、回變菌落數(shù)增幅不是很大卻結(jié)果呈陽性（MR>2）。最低濃度12.5％樣品組沒有導(dǎo)致顯著性回復(fù)突變（除外TA98菌株在不加S9的情況下）。銅絲浸提液各檢測樣品呈現(xiàn)了與新型材料組相同的趨勢，經(jīng)過比較在銅離子濃度相同時，所對應(yīng)的新型材料浸提液樣品與銅絲浸提液樣品在加與不加S9的情況下，對于TA98和TA100兩種檢測菌株，相應(yīng)的MR值間比較無顯著性差異（P>0.05）。另外，在加入S9后，多數(shù)樣品誘發(fā)突變菌落數(shù)降低，提示S9中的多功能的單加氧酶

14、可能對致突變物有解毒作用。
　　 結(jié)論：Ames試驗在彗星試驗基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提示新型絡(luò)合銅納米高分子復(fù)合材料浸提液可能導(dǎo)致遺傳毒性，而且經(jīng)過與相同銅離子濃度的含銅宮內(nèi)節(jié)育器銅絲浸提液進(jìn)行比較，進(jìn)一步提示該新型材料所導(dǎo)致的遺傳毒性與材料中釋放的銅離子相關(guān)。
　　 第二部分 用于輸精管節(jié)育裝置的新型無銅材料體外遺傳毒性的 研究
　　 目的：鑒于銅離子體外遺傳毒性試驗可能導(dǎo)致遺傳物質(zhì)損傷，考察用于男性輸精管節(jié)育裝置的新

15、型無銅納米高分子復(fù)合材料的體外遺傳毒性。
　　 方法：首先檢測該新型材料的細(xì)胞毒性，運用MTT比色法，檢測該材料不同濃度浸提液（100％，50％，25％）對TM4細(xì)胞活率的影響；然后采用彗星試驗，檢測這三個濃度浸提液對TM4細(xì)胞DNA損傷的影響；同時結(jié)合Ames試驗，檢測該新型材料在模擬體液浸提120小時后，100％，50％，25％，12.5％四個濃度樣品在加與不加S9時，對兩種組氨酸缺陷型菌株（TA98，TA100）的致突變作

16、用。
　　 結(jié)果：MTT比色試驗顯示，該材料浸提液在100％，50％，25％時均未出現(xiàn)細(xì)胞生長抑制，細(xì)胞毒性程度為0-1級；彗星試驗結(jié)果顯示，以上三個濃度均未導(dǎo)致明顯DNA斷裂，Olive尾距與陰性對照組比較無顯著性差異（P>0.05）；Ames試驗結(jié)果表明，在加與不加S9時，對于兩種檢測菌株，各濃度樣品MR值均小于2，新型無銅納米高分子復(fù)合材料無致突變作用。
　　 結(jié)論：經(jīng)過一系列體外細(xì)胞毒性及遺傳毒性試驗，用于輸精管