不同來源阿薩希毛孢子菌體外藥敏及氟康唑耐藥誘導(dǎo)研究.pdf

1、研究背景:
　　 近30年來，隨著激素和免疫抑制劑的應(yīng)用，惡性腫瘤、大面積燒傷、器官移植、血液病、艾滋病患者日益增多，條件性致病真菌感染的發(fā)病率呈顯著上升趨勢，已成為這些患者死亡的主要原因之一。近20年來，除了白念珠菌、煙曲霉、隱球菌等常見致病真菌外，另一個(gè)重要致病真菌——阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii,T.asahii的感染率呈逐年上升趨勢。T.asahii也是一種條件性致病真菌，廣泛存在于自然環(huán)境和定

2、植于人體的部分組織器官中。它可通過內(nèi)置導(dǎo)管、引流管、燒傷患者破損的皮膚、腸黏膜微生物易位及呼吸道吸入等多種途徑致病，導(dǎo)致皮膚淺表感染、夏季超敏性肺炎以及內(nèi)臟器官的深部感染。免疫抑制、免疫缺陷及免疫低下宿主是T.asahii感染的主要易感人群，但是，近些年在免疫正常人群也不斷有該菌播散性感染的報(bào)道。目前的研究數(shù)據(jù)表明:該菌侵襲性感染的死亡率高達(dá)80～90％。
　　 國內(nèi)外研究已經(jīng)表明:T.asahii對大多數(shù)臨床一線抗真菌藥如兩性

3、霉素B、氟胞嘧啶、卡泊芬凈等均耐藥，僅對少數(shù)抗真菌藥如唑類藥物——伏立康唑、氟康唑、伊曲康唑等敏感。然而，近10多年來，T.asahii對唑類藥物耐藥以及唑類藥物治療T.asahii感染失敗的報(bào)道越來越多，體外藥敏試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了不少T.asahii臨床分離菌株對氟康唑不敏感。T.asahii對唑類藥物產(chǎn)生耐藥使該菌感染的治療及防控變得更加棘手。因此，T.asahii的唑類藥物耐藥機(jī)制研究顯得非常重要、十分迫切。目前T.asahii的唑類藥

4、物耐藥機(jī)制尚不清楚，而獲得耐藥菌株是研究耐藥機(jī)制的前提與基礎(chǔ)。目前獲得耐藥株的途徑主要是通過臨床分離及實(shí)驗(yàn)室體外誘導(dǎo)。臨床分離耐藥株受多種因素影響，較難獲得，且更難獲得同一菌株的敏感母本及耐藥子代，影響了研究的可靠性。實(shí)驗(yàn)室體外誘導(dǎo)獲得耐藥株的方法具有操控性好、易于獲得與敏感母本基因型相同的耐藥予代等優(yōu)點(diǎn)，在其他真菌的耐藥機(jī)制研究中已得到廣泛應(yīng)用。
　　 既往T.asahii的研究主要集中于臨床分離株，目前尚無對不同分離來源的環(huán)

5、境株與臨床株的體外藥物敏感性進(jìn)行研究以及關(guān)于T.asahii抗真菌藥體外誘導(dǎo)耐藥株的報(bào)道。本研究首先對不同分離來源的T.asahii進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)，篩選出臨床株和環(huán)境株中的敏感菌株，然后用氟康唑以濃度梯級(jí)倍增的方法將篩選出來的臨床敏感菌株及環(huán)境敏感菌株分別在體外進(jìn)行誘導(dǎo)，獲得耐藥子代菌株，再進(jìn)行耐藥子代菌株的回復(fù)性研究，觀察它們的耐藥穩(wěn)定性，為下一步研究T.asahii的耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 研究目的:
　　

6、 觀察不同分離來源的T.asahii對6種常見抗真菌藥物體外敏感性的差異，篩選出臨床株和環(huán)境株中對氟康唑敏感的菌株;用氟康唑?qū)⒚舾芯暝隗w外誘導(dǎo)，獲得耐藥子代菌株，并對耐藥子代菌株進(jìn)行回復(fù)性研究，觀察它們耐藥穩(wěn)定性。
　　 研究方法:
　　 1.以我中心保藏的12株不同分離來源的T.asahii為研究對象，選用PDA培養(yǎng)基上37℃生長24h的菌落，在90mmRPMI真菌藥敏平板上，采用E-test試條測定6種常見抗真菌藥

7、物對各菌株的MIC值。篩選出臨床分離株及環(huán)境分離株中氟康唑MIC值最低的兩株菌;
　　 2.將篩選出的兩株敏感菌株，在含氟康唑濃度梯級(jí)倍增的PDA固體培養(yǎng)基中分別傳代培養(yǎng)，每次轉(zhuǎn)種前均用E-test法測定氟康唑?qū)ζ涞腗IC值，直至其MIC值＞256μg/ml;
　　 3.將誘導(dǎo)后氟康唑MIC值＞256μg/ml的耐藥子代菌株，分別在不含氟康唑的PDA培養(yǎng)基中連續(xù)傳代，培養(yǎng)18天，并監(jiān)測每代菌株的MIC值，觀察它們的耐藥穩(wěn)

8、定性。
　　 結(jié)果:
　　 1.氟胞嘧啶及阿尼芬凈對12株不同來源的T.asahii均無體外活性，它們的MIC值均大于32μg/ml;兩性霉素B對T.asahii活性差且具有不穩(wěn)定性，多次重復(fù)MIC值差異較大，大部分菌株的MIC值大于32μg/ml，其中CBS2479、BZP07005R、BZP09001的MIC值較低且不穩(wěn)定，分別為0.75μg/ml、1.00μg/ml、1.00μg/ml;唑類抗真菌藥對T.asahi

9、i有較好的體外活性，特別是伏立康唑最敏感，大部分菌株的MIC值小于0.016μg/ml，最高的MIC值也僅為0.125μg/ml;與臨床株相比，環(huán)境株對唑類藥物更加敏感，所有環(huán)境株對伏立康唑的MIC值均小于0.016μg/ml; CBS2479和CBS8904分別是臨床及環(huán)境分離來源菌株中對氟康唑最敏感菌株;
　　 2.氟康唑MIC值分別為0.25μg/ml及1.5μg/ml的T.asahii敏感株——CBS2479和CBS89

10、04均被成功誘導(dǎo)為氟康唑MIC值＞256μg/ml的耐藥子代菌株——CBS2479R/CBS8904R，MIC值（耐藥性）分別較誘導(dǎo)前提高了170倍和1024倍;
　　 3.將誘導(dǎo)成功的不同來源耐藥子代菌株，分別在不含氟康唑PDA培養(yǎng)基中連續(xù)傳代18天，CBS2479R的氟康唑MIC值未見下降;CBS8904R氟康唑MIC值逐漸下降，至第18天時(shí)降為64μg/ml，較回復(fù)前下降了4倍。
　　 結(jié)論:
　　 不同分

11、離來源的T.asahii體外藥物敏感性對不同抗真菌藥有所不同，氟胞嘧啶及阿尼芬凈對12株不同來源的T.asahii均無體外活性，兩性霉素B對T.asahi活性差且具有不穩(wěn)定性，伏立康唑?qū).asahii最敏感;臨床株與環(huán)境株之間體外藥物敏感性有顯著差異，環(huán)境分離株的藥物敏感性更高一些;氟康唑在體外能將不同來源的、對其敏感的T.asahii成功誘導(dǎo)為具有高度耐藥性的子代菌株，且不同來源T.asahii其耐藥子代菌株的耐藥穩(wěn)定性不相同，臨床