不同來源成體干細胞體外誘導(dǎo)向胰島β細胞的實驗研究.pdf

1、目的：每年有數(shù)以百萬的人們被診斷患有I型糖尿病，I型糖尿病是一種自身免疫性疾病，即為胰島素依賴性糖尿病，目前的研究表明，可能是由于自身免疫性破壞導(dǎo)致胰島β細胞受損所造成的，所以患者需要終身注射胰島素，并且沒有治療這種疾病的好方法。最近幾年世界上的研究表明，通過移植多向分化潛能的祖干細胞來治療I型糖尿病，成為一種新的治療手段。干細胞在來源上可分為胚胎干細胞與成體干細胞，因胚胎干細胞用于臨床產(chǎn)生諸多倫理道德等問題的爭議，所以選擇成體干細胞進

2、行細胞治療的種子，是不錯的選擇。本課題采用的三種成體干細胞分別為經(jīng)血源子宮內(nèi)膜干細胞（MENSC）、臍帶間充質(zhì)干細胞（UCMSC）與牙髓間充質(zhì)干細胞（DPSC）；其中MENSC源于女性經(jīng)血的間充質(zhì)干細胞，其取材方便來源廣泛，UCMSC取自于妊娠后婦女的臍帶，利用“組織植塊法”分離得到，DPSC來源于磨牙的牙髓，該三種成體干細胞均具有低免疫原性、高增殖力、多向分化潛能等特性。本課題在于比較以上三種不同來源的成體干細胞體外誘導(dǎo)向胰島β細胞的

3、分化能力差異，為后續(xù)臨床前實驗做基礎(chǔ)，也為干細胞治療的理想種子細胞篩選基礎(chǔ)性研究。
　　方法：1、比較MENSC、UCMSC與DPSC的生物學(xué)基本特性，采用生長動力學(xué)實驗方法，計算并繪制生長曲線和最大比生長率，利用流式細胞術(shù)實驗方法鑒定并分析三種成體干細胞的表面抗原標(biāo)記物。
　　2、多向分化潛能的實驗比較三種不同來源的成體干細胞，骨方向分化和成脂方向分化的體外實驗研究。其中成骨分化實驗中，在分化末期通過茜素紅染色及半定量分析

4、，比較差異性；成脂分化實驗中，在分化末期通過油紅O染色及半定量分析，比較三種間充質(zhì)干細胞的多能分化差異性。同時驗證MENSC，UCMSC與DPSC的多能分化能力。
　　3、采用“三步法”體外定向誘導(dǎo)MENSC、UCMSC與DPSC向胰島樣細胞分化，并通過 I型鼠尾膠原提供干細胞三維生長環(huán)境；通過形態(tài)學(xué)、DTZ染色、免疫熒光分析、熒光定量PCR與ELISA等多方面評價誘導(dǎo)效果。
　　結(jié)果：1、經(jīng)分離提取的原代MENSC、UCM

5、SC與DPSC細胞形態(tài)總體為梭形，其中UCMSC的細胞形態(tài)更為細長，MENSC的細胞形態(tài)更為飽滿，DPSC細胞形態(tài)則相對偏??；生長動力學(xué)中，MENSC細胞倍增時間為65.5 h，UCMSC細胞倍增時間為44.3h，DPSC細胞倍增時間為53.5h；最大比生長率分別為0.0106 s-1、0.0156 s-1與0.0130 s-1。三種干細胞均陽性表達的間充質(zhì)表面抗原物為 CD29，CD44，CD90，陰性表達 CD14，CD34，CD4

6、5，證明三種干細胞具有較低的免疫原性。
　　2、三種成體間充質(zhì)干細胞均具有成骨和成脂分化潛能。其中在成骨分化中，臍帶間充質(zhì)干細胞（UCMSC）與牙髓間充質(zhì)干細胞（DPSC）誘導(dǎo)能力優(yōu)于子宮內(nèi)膜干細胞（MENSC）；成脂分化中，子宮內(nèi)膜干細胞（MENSC）與臍帶間充質(zhì)干細胞（UCMSC）分化能力優(yōu)于牙髓間充質(zhì)干細胞（DPSC）。
　　3、三種間充質(zhì)干細胞進行“三步法”誘導(dǎo)后，子宮內(nèi)膜干細胞（MENSC）形成類圓球形（Lange

7、rhans）胰島細胞團的效果優(yōu)于臍帶間充質(zhì)干細胞（UCMSC）與牙髓間充質(zhì)干細胞（DPSC）；經(jīng)過雙硫腙（DTZ）染色后，誘導(dǎo)后的MENSC胰島樣細胞團呈現(xiàn)深紅色，而UCMSC與 DPSC誘導(dǎo)后形成的細胞團并為能染色呈現(xiàn)深紅色。MENSC進行免疫熒光檢測，胞外胰島素表達為陽性，UCMSC表達為陰性，DPSC表達量極其微弱。ELISA檢測結(jié)果顯示，MENSC在經(jīng)誘導(dǎo)后，胰島樣細胞團在高糖刺激情況下，胰島素分泌量為11.95 mU/L，低糖

8、誘導(dǎo)下胰島素分泌量為3.46 mU/L；UCMSC分別在高糖培養(yǎng)基刺激和低糖刺激下，胰島素的分泌量為6.61 mU/L與2.75 mU/L；DPSC分別在高糖刺激和低糖刺激下，胰島素的分泌量為5.26 mU/L與4.11 mU/L。其中只有MENSC經(jīng)過誘導(dǎo)后形成的胰島樣細胞分泌量與葡萄糖的濃度成正相關(guān)。熒光定量PCR顯示MENSC在三步誘導(dǎo)后INS，NGN3以及GLUT-2呈陽性表達，而UCMSC實驗組弱于對照組的表達，DPSC僅有N