新型多聚體微泡介導的基質金屬蛋白酶-2靶向顯像實驗研究.pdf

1、實驗一實時心肌超聲造影對大鼠心肌微循環(huán)灌注的評價
　　目的：探討實時心肌超聲造影對大鼠心肌微循環(huán)灌注的評價中的應用價值。
　　方法：雄性SD大鼠（n=12），手術結扎冠狀動脈左前降支（LAD）前后分別進行經(jīng)靜脈團注/連續(xù)滴注超聲造影劑BR1進行實時心肌超聲造影（RT-MCE）。對心肌內(nèi)聲學強度進行連續(xù)分析。以組織圖像為參考，在造影圖像中分別在LAD供血區(qū)和LCx供血區(qū)放置兩個感興趣區(qū)。根據(jù)心電圖信號，自動選擇舒張末期（ED）

2、和收縮末期（ES）的系列圖像，并單獨分析在每個時間點下每個興趣區(qū)的信號強度。連續(xù)滴注中，心肌聲學強度（SI）隨時間的變化符合指數(shù)函數(shù)關系：Y=A（1-e-βt），其中Y代表任何給定時間的心肌SI；A代表曲線平穩(wěn)時期SI；β代表SI上升率（曲線斜率）；t代表FLASH后的時間。通過A和β的乘積代表心肌血流量（MBF）。團注中，心肌內(nèi)SI隨時間的變化曲線符合伽馬變量函數(shù)：y=At-e-αt，其中Y代表心肌信號強度，t代表時間，A為比例系數(shù)，

3、α值與造影劑的傳輸速度成正比，峰值信號強度（PSI）A/αe。超聲造影之后，經(jīng)靜脈注射1.5mCi的99mTc-sestamibi，測定心肌內(nèi)核素含量作為評價心肌灌注的指標。
　　結果：連續(xù)滴注及團注在冠脈結扎前后均未對大鼠心率造成明顯影響。結扎LAD后，有部分大鼠出現(xiàn)1至2次的室性早搏?；A狀態(tài)下，大鼠左室心肌各節(jié)段室壁增厚率無顯著性差異；冠狀動脈結扎后，與LCx灌注區(qū)的增厚率相比，LAD灌注區(qū)的室壁增厚率明顯減低（LAD灌注區(qū)

4、:21.86±5.03vsLCx灌注區(qū)：57.41±10.58,p<0.01）。單次0.4ml/kg團注和0.9ml/kg·minBR1連續(xù)滴注均獲取了乳頭肌水平高質量的實時造影短軸圖像?；A狀態(tài)，左心室腔內(nèi)、LAD灌注區(qū)和LCx灌注區(qū)心肌內(nèi)的信號持續(xù)增強，且均勻一致，（連續(xù)滴注：A*βLAD:48.27±3.72dB,A*βLCx:47.89±5.43dB,p>0.05；團注：PSI LAD:48.27±3.72dB,PSI LCx:

5、47.89±5.43dB,p>0.05）。LAD結扎后，左心室的LAD灌注區(qū)心肌內(nèi)可觀察到明顯的造影劑灌注缺損（連續(xù)滴注：A*βLAD:5.42±1.57dB,A*βLCx:46.52±5.32dB,p<0.05；團注：PSI LAD:2.11±0.67dB,PSI LCx:20.68±0.72dB,p<0.05）。兩種超聲造影方法所計算的心肌灌注缺損面積結果間無明顯差異（連續(xù)滴注：29.5±13.3％vs.團注：29.67±13.1％

6、,P>0.05）,且這兩種方法均與組織樣本的伊文氏藍染色有良好的相關性。（連續(xù)滴注：r=0.95；團注：r=0.94）。在舒張末期，團注中的PSI值和連續(xù)滴注中的A*β值均高于收縮末期。但是，各項參數(shù)的LAD/LCx比值無明顯變化（P<0.05）。舒張末期大鼠心內(nèi)膜圖像顯示優(yōu)于收縮末期圖像。
　　結論：RT-MCE技術可對大鼠的心肌灌注和心肌收縮功能可進行定量和定性的評估，均具有較好的可行性。定量評價心肌灌注方面要優(yōu)于團注；但造影

7、劑團注后缺血區(qū)域與正常區(qū)域的PSI比值（PSI ratio）可用于定量評估心肌梗塞前后梗死區(qū)域心肌的心肌灌注。RT-MCE可實時定性評估心肌微循環(huán)灌注。與連續(xù)滴注相比，團注由于造影劑相對濃度較高更便于通過肉眼觀察把識別灌注缺損區(qū)域BR1。舒張末期圖像比收縮末期圖像更適合于心肌灌注分析。
　　實驗二新型多聚體靶向超聲造影劑的實驗研究
　　目的：研制一種具有靶向結合能力的新型多聚體型超聲微泡。
　　方法：將聚乙二醇（PEG

8、）、糖類物質、脂類物質、磷脂類物質、聚合物、改性蛋白質、表面活性劑、高級脂肪醇類或高級脂肪酸類的一種或幾種按不同的比例制成微泡膜材料，通入六氟化硫（SF6）氣體同時用超聲處理儀聲振處理上述冷卻后的成膜溶液，得到微泡懸浮液。采用上浮法進行微泡的分級分離。對不同成膜溶液制成的多聚體型微泡的直徑、濃度、穩(wěn)定性進行測定，確定最佳成膜溶液配制方案。將微泡與基質金屬蛋白酶單克隆抗體共浴后,制成靶向微泡，應用熒光顯微鏡、流式細胞儀確定熒光標記的單克隆

9、抗體與微泡表面的結合。
　　結果：各種聚乙二醇、乳化劑及穩(wěn)定劑的選用和配比比例及微泡膜溶液中油相和水相的比例均會對所制備微泡造影劑的濃度、穩(wěn)定性、彈性等性質產(chǎn)生影響。通過對成膜材料的配比進行優(yōu)化，可得到一種較為理想的新型多聚體微泡造影劑，其微泡直徑為3.36±1.62μm，造影劑溶液終濃度為約為7×109/ml，常溫下可保存5天，4°C下保存2個月。免疫熒光結果顯示結合了熒光標記的抗體的多聚體微泡表面顯示出綠色、均勻一致的強熒光。

10、流式細胞儀亦證實了微泡與帶熒光抗體的有效鏈接。
　　結論：新型多聚體微泡具有良好的理化性質，其中分子量愈高的聚乙二醇制得的微泡愈穩(wěn)定。新型多聚體微泡通過其表面的PEG空間結合臂可有效的與抗體結合形成靶向微泡，成為微泡介導的超聲靶向實驗研究的理想選擇。
　　實驗三特異性超聲靶向造影劑對心肌缺血再灌注后心肌重構中MMP-2的顯像
　　目的：基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）與心肌缺血再灌注（I/R）后心肌重構過程有密切聯(lián)系。

11、本實驗擬證明新型多聚體型超聲造影劑表面可攜帶MMP-2抗體，具有對MMP-2進行靶向顯影的功能。
　　方法：將六氟化硫通入含聚乙二醇（PEG）等物質的成膜溶液中，用超聲聲振法制成一種新的多聚體型微泡，作為正常對照（MBc）。將MMPs-2 IgG1單抗與1x107MBc于4℃反應10min，制成MMP2-靶向性MB（TMB2）。SD大鼠28只，隨機分為缺血再灌注（I/R）一周組（n=14）和正常對照組（n=14）。兩組中各取兩只大

12、鼠進行特異性超聲靶向造影劑體外靶向結合試驗。各組中其余12只大鼠再隨即分為兩組，分別與特異性MMP2靶向造影劑（n=6）及正常對照造影劑（n=6）進行的體內(nèi)結合試驗。體外實驗將TMB2和MBc與組織切片共浴后，清洗掉未與心肌組織結合的微泡，在光學顯微鏡下觀察微泡在心肌組織切片上的分布。體內(nèi)試驗，首先通過靜脈持續(xù)滴注Sonovue 15min結合低頻高能量超聲觸發(fā)顯像增強微血管通透性。10min后,分別將0.2ml TMB2/MBc緩慢注

13、射入兩組大鼠體內(nèi)。手動觸發(fā)高能量(MI=0.60) FLASH影像,觀測心肌內(nèi)正常區(qū)域及心肌重構區(qū)域內(nèi)回聲強度。
　　結果：體外實驗中,心肌缺血再灌注后缺血區(qū)域心肌較正常對側心肌明顯變薄;TMB2在缺血區(qū)域心肌內(nèi)聚集,在正常對側心肌內(nèi)未見特異性造影劑微泡聚集。獲取心臟后觀察發(fā)現(xiàn),前間隔、前壁、側壁可見多少不等的出血點,提示局部微血管滲透性增加后有紅細胞漏出。在I/R組大鼠中,和MMP2-靶向性微泡TMB2反應的6只大鼠中有4只在心

14、肌重構區(qū)域里觀察到MMP2-靶向性微泡TMB2的滯留,顯示為局部回聲增強,且明顯高于對側正常心肌的聲學強度。而正常對照微泡MBc在I/R組大鼠的心肌內(nèi)均未見明顯滯留。對照組大鼠中,兩種微泡均未見明顯的滯留。
　　結論：當微泡被高能量、低頻率超聲破壞時,其瞬時所產(chǎn)生的“聲空化”效應能產(chǎn)生局部、小范圍的毛細管滲漏,為潛在的靶向治療及靶向顯影提供了機會。新型多聚體型超聲造影劑利用其膜表面的PEG空間臂可攜帶MMP-2抗體,通過抗原-抗體