抗CD137L抗體對小鼠sGVHD和aGVHD的抑制效應rhIL18對小鼠骨髓移植后aGVHD的抑制效應.pdf

1、目的： 骨髓移植(bone marrow transplantation，BMT)是治療白血病、惡性腫瘤、再生障礙性貧血以及免疫缺陷等疾病的重要手段。根據(jù)骨髓來源的不同，可以將骨髓移植分為自體骨髓移植(autologous BMT)、同基因骨髓移植(syngeneicBMT)、同種異體骨髓移植(allogeneic BMT)。由于自體骨髓移植骨髓來源于自身、同基因骨髓移植的骨髓來自基因型完全相同的個體，臨床上一般無明顯的排斥反應

2、，移植的成功率高，但其缺點是移植后疾病的復發(fā)率高。同種異體骨髓移植的骨髓來自基因型不同的個體，移植后常出現(xiàn)嚴重的并發(fā)癥-移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)，使骨髓移植失敗，導致成功率降低，但其優(yōu)點是一旦移植成功，疾病的復發(fā)率低。 臨床研究發(fā)現(xiàn)，同種異體BMT后發(fā)生GVHD的病人白血病復發(fā)率明顯低于病情相似但未發(fā)生GVHD的患者，動物實驗進一步證明GVHD具有抗白血病作用(graft-v

3、ersus-leukemia，GVL)，能降低白血病的復發(fā)。根據(jù)這些結果，人們推測自身或同基因型BMT受者白血病復發(fā)的主要原因之一可能是無GVL作用，因此，如果在自身或同基因型骨髓移植后能誘導適度的GVHD產生GVL將可預防白血病的復發(fā)，提高治療效果。Glazier和Bryson等先后用環(huán)孢素A(CsA)短期治療在同基因型骨髓移植的大鼠和小鼠人工誘導出GVHD樣癥狀，稱同基因型GVHD(syngeneic GVHD，SGVHD)，令人們

4、感興趣的是發(fā)現(xiàn)SGVHD同樣具有抗白血病作用。目前，自身骨髓移植后用CsA等藥物短期治療誘導GVHD產生GVL已進入臨床試驗。但由于SGVHD產生的機理尚不清楚，臨床上無法控制GVHD發(fā)生的強度，使其應用受到限制。我們在前期工作中，對SGVHD發(fā)生免疫機制進行了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)：SGVHD鼠結腸IEL 中CD4<'4+>αβT細胞明顯增高，DNαβT細胞降低，二者比例失調；證實SGVHD鼠結腸IEL，細胞Thl類(IL-12、IFN

5、-γ、TNF-α)細胞因子的表達升高；證明是CD4<'+>αβT細胞而不是CD8<'+>T細胞在SGVHD發(fā)生中發(fā)揮重要作用；同時發(fā)現(xiàn)協(xié)同刺激分子CD137在SGVHD小鼠結腸中表達升高。已知CD137和CD137L是繼CD28和B7之外的另一對重要的T細胞協(xié)同刺激分子，可依賴或不依賴CD28-B7途徑活化T細胞，在免疫應答、免疫調節(jié)、腫瘤免疫和自身免疫性疾病的治療等方面發(fā)揮著舉足輕重的作用，具有潛在的臨床應用價值，但目前有關CD137

6、協(xié)同刺激通路在SGVHD中的作用尚未見報道。因此本研究的目的之一是用抗CD137L抗體阻斷CD137-CDl37L信號通路觀察對小鼠SGVHD發(fā)生的影響，為進一步闡明SGVHD的發(fā)生機制提供新的依據(jù)，為防止自身骨髓移植后白血病的復發(fā)提供新的思路。 GVHD是同種異體骨髓移植的主要并發(fā)癥，嚴重影響了移植的成功率，防治GVHD成為提高骨髓移植成功率的關鍵問題。已有的研究證實，參與GVHD的免疫細胞主要是T淋巴細胞，骨髓移植后供者T細胞

7、在受者同種異型抗原的刺激下，活化、增殖、分化成效應性T細胞，通過釋放各種細胞因子等機制引起受者組織器官的病理損傷。因此，阻斷同種異型抗原反應性T細胞的活化、抑制細胞因子引起的損傷或直接抑制效應性T細胞的作用成為防治GVHD的重要策略。本研究根據(jù)GVHD的發(fā)病機制，從抑制T細胞活化、抑制效應性T細胞的作用和調節(jié)細胞因子的作用等三方面，探索了防治GVHD的新方法。(1)從抑制T細胞活化方面，我們根據(jù)T細胞活化的雙信號理論及我們多年來在CD1

8、37-CD137L協(xié)同刺激通路研究的工作基礎，研究了用抗-CD137L抗體阻斷該通路后對同種異體骨髓移植后GVHD的影響；(2)從抑制效應性T細胞的作用方面，根據(jù)調節(jié)性T細胞(regulatory TceⅢ,Treg)研究的最新進展，建立了多次輸血體內誘導受者特異性調節(jié)性T細胞產生的方法，研究了這種受者特異性Treg對效應性T細胞的抑制效應和對GVHD的影響，并在此基礎上進一步探索了輸入受者特異性Treg細胞和阻斷CDl37協(xié)同刺激通

9、路對GVHD的聯(lián)合抑制效應；(3)從細胞因子的調節(jié)作用方面，根據(jù)細胞因子研究的新進展，在前期研究中利用基因工程的方法，表達并純化了新近發(fā)現(xiàn)的細胞因子IL-18，在本研究中進一步研究了該細胞因子在GVHD的作用(詳見第二部分)。 總之，本部分研究有兩個目的：一是用抗CDl37L抗體阻斷CDl37-CDl37L信號通路觀察對小鼠SGVHD發(fā)生的影響，為進一步闡明SGVHD的發(fā)生機制提供新的依據(jù)，為防止自身骨髓移植后白血病的復發(fā)提供新的

10、思路；二是根據(jù)同種異型GVHD的發(fā)病機制，通過用抗CDl37L抗體阻斷協(xié)同刺激通路抑制T細胞活化、通過體內誘導受者特異性調節(jié)性T細胞來抑制效應性T細胞的作用及用細胞因子IL-18抑制GVHD損傷等三方面，探索了防治GVHD的新方法，為提高骨髓移植的成功率提供新的思路。方法 一、抗CDl37L抗體在小鼠SGVHD誘導中作用的研究 (一)小鼠SGVHD模型的誘導 用致死量的X射線照射受體小鼠，4-6h內移植去Thy．

11、1<'+>T細胞的同基因型骨髓，從移植的當天開始用CsA治療，連續(xù)21d。 (二)SGVHD的評估 停用CsA后，每周稱重小鼠3次，并觀察SGVHD的臨床癥狀(體重降低、腹瀉等)。取小鼠的肝臟和結腸常規(guī)制備組織切片并用H-E進行染色，然后采用雙盲法由病理學家對所有的病理切片進行觀察，并根據(jù)公認的標準對SGVHD進行分級。RT-PCR法檢測小鼠肝臟和結腸組織中CDl37mRNA和細胞因子IL-12，IFN-γ，TNF-α

12、 mRNA水平。 (三)抗CDl37L抗體治療 在模型建立的基礎上，于移植后10d給抗體干預組小鼠腹腔注射抗CDl37L抗體進行干預治療，每周三次，每次200μg，連續(xù)三周。然后按照上述標準觀察SGVHD的發(fā)生情況。 二、抗CDl37L抗體及其聯(lián)合Treg抑制小鼠aGVHD的研究 (一)抗CDl37L抗體體外對T細胞增殖的影響 以C57BL/6小鼠脾臟細胞作為反應細胞，以BALB/c小鼠脾臟細胞作

13、 為刺激細胞進行體外混合淋巴細胞培養(yǎng)，在該反應體系中加入不同濃度的抗CD137L抗體，觀察抗CD137L抗體體外對T細胞增殖的影響；同時收 集培養(yǎng)上清液，用ELISA法檢測上清夜中細胞因子IL-2的濃度。 (二)Treg的體內誘導 乙醚麻醉BALB/c小鼠，無菌操作從頸靜脈采取血液，肝素防凝。然后，通過尾靜脈將肝素防凝全血輸入到供體小鼠C57BL/6體內，輸入量為0.25ml。這種輸血稱為受者特異性輸血(recipi

14、ent specitic transfusion,RST)。每周輸注一次，連續(xù)五次。部分小鼠輸血一次或三次。所有接受輸血的小鼠均于最后一次輸血后七天處死進行以下檢測：1、流式細胞術檢測小鼠脾臟細胞表型 分離受血者小鼠脾臟細胞，將脾臟細胞懸浮在PBS緩沖液中，分別用．PE、PE-Cy-5標記的特異性抗體(CD25、CD4)進行雙色標記。用流式細胞儀測定、分析細胞的表型。 2、RT-PCR檢測Foxp3mRNA和TGF-βmRNA

15、 用Trizol試劑抽提脾細胞總RNA，反轉錄成cDNA，分別用β-actin、Foxp3和TGF-β的引物進行PCR擴增。PCR產物特異性條帶的OD除以來自同一組織的p-actin的OD值使其標準化后比較各自的變化。 3、Treg細胞對混合淋巴細胞反應的影響 利用單向混合淋巴細胞反應檢測上述含有Treg細胞的脾臟細胞對同種異型抗原的反應程度，并檢測輸血次數(shù)對體外T淋巴細胞增殖反應的影響。 (三)小鼠aGVHD的建立

16、 1.制備供體鼠骨髓細胞和脾臟細胞 頸椎關節(jié)脫臼處死供體鼠，75％乙醇浸泡10min，無菌操作分離股骨和脛骨并制備骨髓細胞；無菌操作摘取脾臟，分離脾臟細胞，兩者混合作為移植細胞。 2．骨髓移植 受體鼠為BALB/c小鼠，于移植前24h接受9.0Gy的X-射線照射，然后隨機分為六組：①照射組，②同基因骨髓移植組(稱為對照組)，③同種異基因骨髓移植組(稱為GVHD組)，④同種異基因移植抗CD137L抗體治療組(稱為GVHD

17、+Ab組)，⑤輸血處理的同種異基因骨髓移植組(稱為GVHD+Treg組)，⑥輸血處理的同種異基因移植抗CD137L抗體治療組(稱為GVHD+Treg+Ab組)。通過尾靜脈分別注射不同的骨髓細胞和脾臟細胞。 (四)小鼠aGVHD的評價 根據(jù)參考文獻標準，由高級實驗師觀察小鼠臨床癥狀，由病理學專家進行組織病理學評價。 (五)抗體治療 按照分組要求，分別給予抗體治療組小鼠腹腔注射抗CD137L抗體，隔日一次，連續(xù)10

18、日。 三、統(tǒng)計學分析采用SPSS10.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行檢驗，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。 結果 一、抗CD137L抗體治療可以抑制小鼠SGVHD的發(fā)生 (一)小鼠SGVHD模型建立 小鼠接受致死劑量(9.0Gy)的X射線照射后4-6h內，通過尾靜脈注射同基因骨髓細胞，并于當天腹腔注射環(huán)孢素A(CsA)誘導SGVHD，連續(xù)21d。對照組小鼠均未出現(xiàn)SGVHD，而模型組小鼠SGVHD誘發(fā)率為

19、67％(8/12)。 (二)CD137的檢測 對照組小鼠的結腸和肝臟組織中CD137 mRNA水平較低或檢測不到；SGVHD小鼠結腸和肝臟組織中CD137mRNA水平升高，兩組比較P<0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。 (三)抗CD137L抗體干預可降低小鼠SGVHD的誘發(fā) 上述實驗結果證明，同基因骨髓移植后短期應用CsA治療可誘導出SGVHD。于CsA誘導SGVHD的第10天起，腹腔注射抗CD137L抗體，按照

20、模型誘導的觀察指標觀察抗體干預組小鼠的變化，以判斷抗CD137L抗體對小鼠SGVHD的影響。結果表明，抗CD137L抗體干預治療可減輕臨床癥狀，如體重下降和腹瀉程度減輕、活動力恢復等；可改善組織病理學改變，如小鼠結腸和肝臟組織無或僅有散在炎癥細胞浸潤；抗CD137L抗體可降低小鼠結腸和肝臟組織中細胞因子IL-12，IFN-Y，TNF-α和CD137mRNA的水平以及CD137mRNA的水平，與模型組小鼠相比，兩組差異具有統(tǒng)計學意義(P<

21、0.01)?？笴D137L抗體治療組小鼠SGVHD的誘發(fā)率為25％(3/12)，與模型組小鼠67％(8/12)的SGVHD誘發(fā)率相比，兩者差異具有統(tǒng)計學意義。二、抗CDl37[?？贵w及其聯(lián)合’rreg細胞抑制小鼠aGVHD的發(fā)生(一)抗CDl371?？贵w對體外T細胞增殖的影響 1．抗CDl37[。抗體在體外可抑制混合淋巴細胞增殖反應 在單向混合淋巴細胞培養(yǎng)中，加入不同濃度的抗CDl37L抗體進行培養(yǎng)。結果顯示，第5天時，對照組

22、中的細胞集落增大，而實驗組細胞集落的擴增受到不同程度地抑制。<'3>H-TdR摻入實驗結果顯示，第5天時lμg/ml、2.5μg/ml和5μg/ml抗CDl37L抗體可見抑制作用，但統(tǒng)計學分析未見顯著性差異；而10μg/ml抗CDl37L抗體則可表現(xiàn)出明顯抑制作用，并且隨著濃度的增加，其抑制作用不斷增強，細胞集落的增長受到明顯抑制，與對照組相比，P<0.05。 2．抗CDl37IL抗體在體外可抑制細胞因子IL-2的產生 用ELI

23、SA測定上清液中IL-2的濃度顯示，5d時，濃度為1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml抗CDl37L抗體組的上清液中IL-2的表達量與對照組表達量未見明顯差異，而濃度為10μg/ml、20μg/ml抗-CDl37L抗體組的上清液中IL-2的表達量較對照組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.05。 (二)抗CDl37L抗體治療對小鼠aGVHD的影響 1．抗CDl37L抗體治療對小鼠生存時間的影響 小鼠接受

24、致死劑量X射線照射后進行骨髓移植，GVHD組小鼠僅存活14天，GVHD抗體治療組小鼠則有2/5存活超過26天。 2．抗體治療對小鼠aGVHD臨床癥狀的改變 小鼠接受異基因骨髓移植后，由于供體T細胞識別受者細胞上的同種異型抗原而活化，引起受體鼠出現(xiàn)一系列GVHD臨床癥狀，主要包括體重下降、弓背、翹毛、腹瀉和活動力下降。而抗CDl37L抗體治療組小鼠體重下降和腹瀉程度減輕，活動力有所恢復等。 3．抗體治療可以減輕

25、小鼠結腸和肝臟組織病理學變化 H-E染色顯示，GVHD模型小鼠的病理改變主要表現(xiàn)為：結腸組織腺上皮細胞死亡、脫落，腺體減少，炎細胞浸潤，以及結腸粘膜潰瘍形成、粘膜壞死脫落；肝臟組織中門靜脈擴張、淤血，膽管周圍淋巴細胞浸潤，膽管上皮細胞死亡、脫落，血管內皮細胞炎，實質細胞凋亡等病變。而用抗CDl37L抗體治療后，上述病理變化可明顯減輕，肝臟組織中門脈擴張和淤血現(xiàn)象減輕、匯管區(qū)炎細胞浸潤減少等。說明抗CDl37L抗體治療可以明顯

26、改善同種異基因骨髓移植受體鼠的病理改變。 (三)Treg細胞的體內誘導及其對aGVHD的影響 1．Treg細胞的體內誘導 小鼠接受不同次數(shù)輸血后可發(fā)生如下變化： (1)小鼠脾臟細胞CD4<'+>CD25<'+>T細胞比例升高流式細胞儀檢測結果顯示，正常情況下小鼠脾臟細胞中含有一定比例的Treg細胞，大約為7.2％。輸血之后，小鼠脾臟中CD4<'+>CD25<'+>T細胞所占CD4<'+>T細胞的比例有所增加，

27、于輸血1、3、5次后，脾臟中CD4<'+>CD25<'+>T細胞的比例由正常時的7.2％分別升高為8.4％(P>0.05)、9.8％(P<0.01)和10.2％(P<0.01)。 (2)小鼠脾臟細胞Foxp3 mRNA的表達增加 RT-PCR顯示，正常小鼠脾臟細胞表達低水平Foxp3mRNA，而經過輸血后，小鼠脾臟細胞內Foxp3mRNA的表達水平升高，輸血1次、3次和5次后Foxp3mRNA的水平分別是正常小鼠脾細胞的1.3

28、(P>0.05)、2.5(P<0.01)和3(P<0.01)倍左右。 (3)小鼠混合淋巴細胞反應降低 以輸血處理的C57BL/6小鼠脾臟細胞為反應細胞，以絲裂霉素處理的BALB/c小鼠脾臟細胞為刺激細胞，混合培養(yǎng)5天后，輸血1次小鼠脾臟細胞增殖反應降低，但與正常小鼠對比未見明顯差異，輸血3次和5次后，小鼠脾細胞的增殖反應程度顯著低下，與正常小鼠脾細胞相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 2．Treg細胞對a

29、GVHD的影響 以輸血3次和5次的含有Treg細胞的小鼠骨髓細胞和脾臟細胞進行骨髓移植，結果顯示：GVHD+Treg組小鼠第14天開始死亡，26天時的存活率為25％(1/4)，而GVHD組小鼠接受供體小鼠的骨髓細胞和脾臟細胞后僅存活14天，說明Treg細胞可以延長小鼠的短期存活時間；臨床癥狀積分表明，GvHD+Treg組小鼠體重下降和腹瀉程度減低，翹毛減少，活動力有所增加，因此癥狀積分明顯低于GVHD組小鼠的積分；組織病理檢查發(fā)

30、現(xiàn)，肝臟組織門脈擴張和淤血減輕，匯管區(qū)炎細胞浸潤減少；結腸組織腺上皮細胞壞死和脫落較輕，腺體結構大致正常，固有層炎細胞浸潤減少等。說明Treg細胞可以改善同種異基因骨髓移植后GVHD癥狀，有助于免疫耐受的建立，但單獨使用效果并不理想。 (四)抗CD137L抗體聯(lián)合體內誘導的Treg細胞對aGVHD的影響 雖然上述試驗證明單獨使用抗CDl37L抗體或Treg細胞對GVHD的預防有一定的作用，但并不十分理想，因此進一步探討抗

31、CDl37L抗體聯(lián)合體內誘導的Treg細胞對GVHD的影響非常有必要。利用含有Treg細胞的輸血小鼠骨髓細胞和脾臟細胞進行骨髓移植，移植后當天給受體鼠腹腔注射抗CDl37L抗體，每只每次200μg，隔天注射一次，連續(xù)注射10次，然后觀察小鼠臨床癥狀、生存時間，并進行組織學檢查。結果顯示，GVHD+Treg+Ab組小鼠于20天時開始死亡，26天時的存活率為66％(4/6)，顯著高于GVHD組小鼠、GVHD+Ab組小鼠和GVHD+Treg

32、組小鼠。其臨床癥狀積分較GVHD組小鼠明顯降低，表現(xiàn)為體重下降和腹瀉均減輕，活動較為活潑，無弓背和翹毛現(xiàn)象等。組織病理學檢查證實，GVHD+Treg+Ab組小鼠肝臟組織結構正常，匯管區(qū)炎細胞稀少，但門脈仍有輕微擴張；結腸組織大致結構正常，絨毛和腺體清晰可見，但在固有層仍散在炎細胞浸潤。說明CDl37L抗體聯(lián)合體內誘導的Treg細胞可顯著減輕同種異基因骨髓移植后受體鼠的臨床癥狀和病理變化，延長受體鼠的短期生存時間。 結論和創(chuàng)新性

33、 1．目前有關CDl37協(xié)同刺激通路在SGVHD中的作用尚未見報道。本研究在國內外首先發(fā)現(xiàn)協(xié)同刺激分子CDl37在SGVHD小鼠結腸中高表達，并證明用抗CDl37L抗體阻斷CDl37-CDl37L信號通路，可抑制小鼠SGVHD的病理損傷，為闡明SGVHD的發(fā)生機制提供新的依據(jù)，為防止自身骨髓移植后白血病復發(fā)的提供新的思路 2．根據(jù)急性同種異型骨髓移植后GVHD的發(fā)病機制，從抑制T細胞活化、抑制效應性T細胞的作用兩方面

34、探索了防治GVHD的新方法，為aGVHD的免疫治療提供了新的途徑。 (1)根據(jù)T細胞活化的雙信號理論及我們多年來在CDl37-CDl37L協(xié)同刺激通路研究的工作基礎，在體外證實用抗CDl37L抗體阻斷CDl37-CDl37L信號通路可明顯抑制混合淋巴細胞反應，抑制IL-2的產生；在體內抗CDl37L抗體治療可改善受體鼠aGVHD的癥狀和組織病理變化。為用抗-CDl37抗體治療GVHD提供了實驗依據(jù)。 (2)從抑制效應性T

35、細胞的作用方面，根據(jù)調節(jié)性T細胞(regulatory Tcelll,Treg)研究的最新進展，創(chuàng)新性建立了多次輸血體內誘導受體特異性調節(jié)性T細胞產生的方法，初步研究顯示這種受體特異性Treg可抑制效應性T細胞的作用、減輕GVHD小鼠的病理損傷、延長小鼠的生存時間。 (3)在研究阻斷CDl37協(xié)同刺激通路和轉輸受體特異性Treg單獨對GVHD抑制作用的基礎上，首次運用抗CDl37L抗體聯(lián)合Treg細胞干預GVHD，發(fā)現(xiàn)二者可以