模擬微重力下膠原-殼聚糖-β-TCP修復(fù)體復(fù)合兔成骨細胞和軟骨細胞體外培養(yǎng)的實驗研究.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨缺損是臨床的難題之一，自體關(guān)節(jié)軟骨移植存在來源有限、創(chuàng)傷大、費用高等缺點，異體關(guān)節(jié)軟骨移植難以排除免疫源性的問題。隨著組織工程的發(fā)展，利用人工再生組織來修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損，為臨床解決這一難題提供了新的思路和方法。雖然關(guān)節(jié)軟骨組織工程的研究已經(jīng)取得了很大進展，但仍有大量的問題等待解決。尤其是軟骨和軟骨下骨的分層、斷裂問題，和宿主的整合問題，關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的長期效果等。 目的: 將膠原、殼聚糖與β-磷酸三鈣(Trical

2、ciumPhosphate,TCP)有機復(fù)合，模仿體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨的分層結(jié)構(gòu)，增加支架材料的力學(xué)強度，構(gòu)建膠原/殼聚糖/β-TCP層狀梯度支架材料。分別將擴增的經(jīng)成骨誘導(dǎo)的兔骨髓間充質(zhì)干細胞(BoneMesenchymalStemCells,BMSCs)和軟骨細胞植入其中體外微重力下培養(yǎng)，對照組采用普通培養(yǎng)板培養(yǎng)，觀察成骨細胞和軟骨細胞在膠原/殼聚糖/β-TCP層狀梯度修復(fù)體中的黏附、增殖及生物學(xué)性狀變化，以評價該復(fù)合材料作為關(guān)節(jié)軟骨組織工

3、程支架的可行性，并觀察模擬微重力對細胞及構(gòu)建組織的效用。 方法: 以細胞和支架材料為實驗對象，以普通培養(yǎng)和微重力培養(yǎng)分兩組對照。MTT實驗分組：5個時間組：1天、3天、5天、7天、9天。5個平行孔/組，兩培養(yǎng)組共50孔。 1.成骨細胞和材料復(fù)合：用全骨髓貼壁篩選法培養(yǎng)新西蘭兔原代BMSCs，體外擴增后進行成骨誘導(dǎo)，3周后檢測細胞堿性磷酸酶活性和鈣結(jié)節(jié)生成情況，誘導(dǎo)成功后和修復(fù)體復(fù)合體外普通培養(yǎng)和旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀模擬微重

4、力培養(yǎng)，進行MTT檢測比較兩組細胞增殖情況并觀察模擬微重力對細胞的影響；培養(yǎng)1周后行掃描電鏡檢查觀察成骨細胞在修復(fù)體材料內(nèi)黏附生長情況；4周后，細胞和材料復(fù)合物脫鈣、石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅染色及I型膠原免疫組織化學(xué)染色，觀察成骨細胞的生物學(xué)性狀變化及模擬微重力對復(fù)合物的力學(xué)影響。 2.軟骨細胞和材料復(fù)合：取新西蘭幼兔的關(guān)節(jié)軟骨消化培養(yǎng)軟骨細胞體外培養(yǎng)擴增，取2、3代細胞行s-100細胞免疫化學(xué)染色，收集前4代軟骨細胞作為

5、種子細胞和修復(fù)體復(fù)合體外普通培養(yǎng)和旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀模擬微重力培養(yǎng)，進行MTT檢測比較兩組細胞增殖情況并觀察模擬微重力對軟骨細胞的影響；培養(yǎng)7天后行掃描電鏡檢查觀察軟骨細胞在修復(fù)體材料內(nèi)黏附生長情況；4周后，細胞和材料復(fù)合物進行脫鈣、石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅染色及II型膠原免疫組織化學(xué)染色，觀察軟骨細胞的生物學(xué)性狀變化及模擬微重力對復(fù)合物的力學(xué)影響。 統(tǒng)計學(xué)分析：MTT實驗中，相同時間點兩組之間的比較用兩獨立樣本t檢驗；同組不同時

6、間點比較采用完全隨機設(shè)計單因素方差分析(One-wayANOVA)；兩組整體之間比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析。α=0.05為統(tǒng)計學(xué)檢驗水準(zhǔn)。 結(jié)果: 1.細胞形態(tài)：初接種時BMSCs呈球形，懸浮在培養(yǎng)液中,24h后開始貼壁，細胞呈長梭形，少量多角形，約1周左右細胞鋪滿培養(yǎng)瓶。加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液后細胞生長相對緩慢，其形態(tài)發(fā)生了改變，細胞逐漸增大，進而出現(xiàn)重疊生長。2周后細胞間可見圓形或卵圓形的鈣化結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)周圍細胞呈放射

7、狀分布。堿性磷酸酶染色陽性，VonKossa法檢測出鈣化結(jié)節(jié)。體外單層培養(yǎng)的軟骨細胞呈球形，懸浮在培養(yǎng)液中,5h后開始貼壁，細胞呈扁平狀，大多數(shù)三角形，少量多角形，約1周細胞鋪滿培養(yǎng)瓶，呈“鋪路石”樣。第2、3代細胞S-100免疫細胞化學(xué)染色胞漿內(nèi)呈陽性反應(yīng)。 2.細胞/支架光鏡下觀察：細胞懸液滴加于經(jīng)預(yù)濕處理的復(fù)合支架材料上，支架材料迅速膨脹，證明細胞擴散到支架內(nèi)。接種24h后，倒置顯微鏡下見材料不透明，無法觀察其內(nèi)細胞生長情

8、況，但可見大量成骨細胞或軟骨細胞貼附在材料旁培養(yǎng)板內(nèi)。 3.MTT檢測：成骨細胞和材料復(fù)合后，除第1天兩組之間無顯著性差異外(P=0.706)，其余時間點兩組之間有顯著性差異(P<0.05)，模擬微重力組明顯比培養(yǎng)板組細胞增殖力高。兩組之間整體比較也有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，證明模擬微重力對成骨細胞在修復(fù)體內(nèi)的增殖比普通培養(yǎng)起到了更好的促進作用。軟骨細胞和材料復(fù)合后，不同時間點兩組之間有顯著性差異(P<0.05)，模擬微重

9、力組明顯比培養(yǎng)板組細胞增殖力高。兩組之間整體比較也有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，證明模擬微重力對軟骨細胞在修復(fù)體內(nèi)增殖比普通培養(yǎng)起到了更好的促進作用。 4.掃描電鏡：培養(yǎng)7d后，細胞成團地吸附于修復(fù)體表面及孔隙側(cè)壁，并可見細胞間通過突起相互連接，或伸出偽足貼附于支架孔隙壁上；從復(fù)合支架材料中間切開，普通培養(yǎng)組見其內(nèi)部有少量細胞貼附于孔隙側(cè)壁，模擬微重力組則可見到大量細胞，細胞數(shù)量比普通培養(yǎng)組明顯增多。 5.HE染色和免

10、疫組化結(jié)果：成骨細胞和材料：4周后，材料表面可見大量細胞，內(nèi)部可見部分細胞聚集成團；細胞呈長梭形，細胞團中有基質(zhì)分泌，沉積于細胞周圍；I型膠原免疫組織化學(xué)染色示胞漿內(nèi)呈陽性反應(yīng)。軟骨細胞和材料：4周后，材料表面可見大量細胞黏附成層狀，內(nèi)部亦可見細胞聚集成團；細胞呈圓形或橢圓形，細胞團中有基質(zhì)分泌，沉積于細胞周圍，II型膠原免疫組織化學(xué)染色示胞漿內(nèi)呈陽性反應(yīng)。普通培養(yǎng)組的細胞多聚集在修復(fù)體表面，細胞數(shù)量明顯多于修復(fù)體內(nèi)部，而模擬微重力組材

11、料表面和材料內(nèi)部細胞數(shù)量相差不大，內(nèi)部細胞數(shù)量明顯比普通培養(yǎng)組多。 結(jié)論: 1.成功培養(yǎng)出兔原代軟骨細胞和BMSCs，并成功誘導(dǎo)BMSCs為成骨細胞，為進一步的細胞和材料的接種提供了數(shù)量充足和生物學(xué)性能良好的種子細胞。 2.膠原/殼聚糖/β-TCP層狀梯度復(fù)合體模擬了正常關(guān)節(jié)軟骨分層結(jié)構(gòu)，細胞相容性好，能提供細胞生長的三維環(huán)境。 3.轉(zhuǎn)壁式旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)儀產(chǎn)生的模擬微重力可以使軟骨細胞和成骨細胞在修復(fù)體內(nèi)高密度