骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合改良纖維蛋白凝膠和軟骨細(xì)胞體外共培養(yǎng)成軟骨實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:觀察SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)復(fù)合在改良纖維蛋白凝膠材料上，體外和軟骨細(xì)胞隔離共培養(yǎng)6周后，BMSCs在支架材料內(nèi)分化成軟骨組織情況，為組織工程軟骨的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:1.使用3天大小SD大鼠，獲取股骨和脛骨骨髓，通過全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)BMSCs，傳代至第3代。定期顯微鏡觀察細(xì)胞增殖、生長變化過程。同時(shí)用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(L-DMEM-10

2、％ FBS，100nmol/L DEX、10mmolβ-磷酸甘油鈉、50ug/mlVc)，成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(L-DMEM-10％FBS，500mmol/L DEX、0.5mmol/L IBMX、10ug/ml人胰島素，50μ mol/L吲哚美辛)誘導(dǎo)BMSCs向成骨、成脂分化。茜素紅和油紅O分別染色，以檢測成骨、成脂誘導(dǎo)效果;同時(shí)改良二步酶消化法獲得SD大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，傳至第1代。2.實(shí)驗(yàn)將分為A，B，C三組，A組（軟骨細(xì)胞組，陽性對

3、照組），B組（軟骨細(xì)胞組+BMSCs共培養(yǎng)組），C組（BMSCs組，陰性對照組）。分別擴(kuò)增BMSCs和軟骨細(xì)胞，待細(xì)胞80％-90％融合時(shí)消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度分別為2×106/ml和1×106/ml，吸取第1代軟骨細(xì)胞接種于Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)中的上室，下室植入第3代BMSCs和改良纖維蛋白凝膠支架復(fù)合物，共培養(yǎng)系統(tǒng)中按軟骨細(xì)胞∶BMSCs=1∶2作為共培養(yǎng)（B組）。軟骨細(xì)胞和BMSCs分別單獨(dú)復(fù)合上述支架并加含10％FB

4、S的L-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)作為對照組（A組，C組），每個(gè)支架內(nèi)細(xì)胞總數(shù)為5×105個(gè)，體外培養(yǎng)6周后取樣本進(jìn)行大體觀察、濕重稱量、組織學(xué)切片、糖胺多糖檢測、免疫組化、RT-PCR檢測Ⅱ型膠原mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:1.顯微鏡下觀察到的BMSCs形態(tài)一致，呈紡錘形，細(xì)胞密度增高后呈漩渦樣生長。BMSCs經(jīng)多向誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后，染色皆強(qiáng)陽性。2.在體外環(huán)境培養(yǎng)下，支架大體觀察顯示A組和B組培養(yǎng)構(gòu)建的組織工程軟骨體積大，能保持支架初始

5、形態(tài)，表面有光澤，內(nèi)有少量膠凍狀物質(zhì)沉積，半透明狀，觸之彈性較好。組織學(xué)染色顯示B組中含大量軟骨細(xì)胞陷窩樣結(jié)構(gòu)，基質(zhì)中見規(guī)律分布的藍(lán)紫色異染顆粒。3.死-活細(xì)胞染色顯示BMSCs和軟骨細(xì)胞分別在凝膠支架內(nèi)生長良好，只有極少數(shù)被染成紅色的老化細(xì)胞;4.A組、B組濕重均高于C組，且差異具有顯著性(p＜0.05)，而B組蛋白聚糖(GAG)含量較A組和C組均有差別，與C組差異具有顯著性(p＜0.05);5.Ⅱ型膠原免疫組化顯示B組和A組切片細(xì)胞

6、胞漿及細(xì)胞外基質(zhì)可見片狀或團(tuán)塊狀棕色顆粒染色，此為Ⅱ型膠原表達(dá);6.RT-PCR法結(jié)果顯示B組Ⅱ型膠原基因的表達(dá)水平較A組稍高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。
　　結(jié)論:1.采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法獲取的SD大鼠BMSCs在體外與同種異體SD大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)后可向軟骨細(xì)胞分化;2.改良的纖維蛋白凝膠和種子細(xì)胞的生物相容性好，可以作為注射式研究支架使用;3.少量軟骨細(xì)胞可以誘導(dǎo)改良纖維蛋白凝膠內(nèi)BMSCs分化為軟骨細(xì)胞，并形