兔骺板軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)、鑒定及其細(xì)胞表型的研究.pdf

1、背景：骺板損傷占小兒全部長(zhǎng)管狀骨骨折的15％-30%，10%的骺板損傷將導(dǎo)致骨骼及關(guān)節(jié)畸形發(fā)育，不但給兒童心理帶來嚴(yán)重影響，而且影響肢體功能，甚至喪失勞動(dòng)能力[1]。組織工程技術(shù)的發(fā)展為治療骺板損傷帶來新的希望，大多數(shù)學(xué)者將重點(diǎn)放在組織工程骺板的構(gòu)建上，并取得初步的成功。因?yàn)楂@得容易，人們最初將注意力放在軟骨細(xì)胞上，但研究發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞在體外擴(kuò)增培養(yǎng)過程中會(huì)出現(xiàn)去分化和生物學(xué)功能衰退，并以合成和分泌軟骨基質(zhì)能力下降或消失為標(biāo)志，因此具有生

2、長(zhǎng)潛力的軟骨母細(xì)胞一骺板軟骨細(xì)胞成為新的研究熱點(diǎn)。
　　目的：體外培養(yǎng)兔骺板軟骨細(xì)胞，探索簡(jiǎn)便、高效的細(xì)胞培養(yǎng)方法。對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行初步研究，觀察細(xì)胞鏡下形態(tài)、電鏡下細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，鑒定細(xì)胞是否分泌蛋白聚糖及其含量，鑒定細(xì)胞是否能合成II型膠原蛋白及是否表達(dá)相應(yīng)mRNA。為骺板組織工程尋找良好的種子細(xì)胞，為下一步基因轉(zhuǎn)染結(jié)合支架材料修復(fù)骺板損傷提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：選取3周齡新西蘭幼兔18只、雌雄不限、健康，體重約250-3

3、00g。分別切取三個(gè)部位的軟骨(①股骨遠(yuǎn)端及脛骨近端的骺板軟骨;②髂骨;③肋軟骨，經(jīng)改良三步酶消化獲得細(xì)胞。將獲得軟骨細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中原代、傳代體外培養(yǎng)。分別取細(xì)胞懸液計(jì)算細(xì)胞產(chǎn)量和細(xì)胞成活率并用倒置顯微鏡及透射電鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。MTT四唑鹽比色法檢測(cè)不同代次骺板軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)活性。Alcian blue染色確定培養(yǎng)細(xì)胞有蛋白聚糖生成及定量檢測(cè)，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)II型膠原蛋

4、白產(chǎn)生， PCR證實(shí)細(xì)胞有II型膠原蛋白mRNA生成。
　　結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)方法體外培養(yǎng)幼兔骺板軟骨細(xì)胞，收集過程簡(jiǎn)便、高效。培養(yǎng)過程中觀察到股骨遠(yuǎn)端及脛骨近端的骺板軟骨細(xì)胞在單位重量的細(xì)胞產(chǎn)量、生長(zhǎng)速度和分化速度上優(yōu)于髂骨、肋軟骨細(xì)胞，但在生物學(xué)形態(tài)上，三個(gè)部位的細(xì)胞無明顯差別。骺板軟骨細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)及傳代的生長(zhǎng)全過程，多次傳代后細(xì)胞增殖能力逐漸降低，細(xì)胞形態(tài)逐漸向“纖維化”細(xì)胞轉(zhuǎn)變。前3代細(xì)胞具有較高的生物學(xué)及功能學(xué)特性表達(dá)。從第4

5、代以后細(xì)胞形態(tài)改變逐漸喪失骺板軟骨細(xì)胞特有結(jié)構(gòu)，軟骨細(xì)胞所特有的II型膠原及蛋白多糖漸消失，出現(xiàn)去分化現(xiàn)象。PCR檢測(cè)有II型膠原mRNA的表達(dá)、Alcian blue染色顯示第3代細(xì)胞蛋白聚糖含量高，MTT顯示第2、3、4代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈倒“S”型，第2、3代細(xì)胞活性明顯優(yōu)于第4代，培養(yǎng)細(xì)胞均于第10天出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制。
　　結(jié)論：1.兔骺板軟骨細(xì)胞通過改良三步酶消化法獲取方便，消化較徹底，存活率高，可獲取大量骺板軟骨細(xì)胞。2.體外