重組人白蛋白融合干擾素在畢赤酵母中的表達(dá)及穩(wěn)定性研究.pdf

1、目的：用電轉(zhuǎn)化方法將線(xiàn)性化重組表達(dá)載體質(zhì)粒pPIC9K-HSA-IFNα-2b轉(zhuǎn)化整合入畢赤酵母宿主菌SMD1168，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)出具有生物活性的目的蛋白，并對(duì)轉(zhuǎn)化子表達(dá)條件及遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行初步研究。 方法：提取重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-HSA-IFNα-2b，小量限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切鑒定，鑒定后的重組質(zhì)粒進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶SalI酶切線(xiàn)性化，純化經(jīng)單酶切線(xiàn)性化的重組表達(dá)質(zhì)粒DNA并電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母菌(PPastoris)SMD

2、1168。將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定和Mut表型鑒定并用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，將表達(dá)上清進(jìn)行Western-Blot鑒定，抗G418抗性鑒定及用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定融合干擾素的表達(dá)水平。Wish細(xì)胞-VSV病毒系統(tǒng)的細(xì)胞病變抑制法(CPE)測(cè)定表達(dá)蛋白的抗病毒活性及其效價(jià)。在搖瓶培養(yǎng)條件下，初步研究了甲醇誘導(dǎo)濃度及菌體誘導(dǎo)起始OD600值兩因素對(duì)轉(zhuǎn)化子表達(dá)水平的影響。最后，對(duì)轉(zhuǎn)化子基因及表達(dá)水平的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行鑒定。 結(jié)果：

3、通過(guò)電轉(zhuǎn)化方法成功將酶切線(xiàn)性化重組表達(dá)質(zhì)粒DNA整合入宿主菌基因組，并在甲醇誘導(dǎo)條件下成功表達(dá)出具有生物學(xué)活性的目的蛋白。用酶聯(lián)免疫法(ELISA)及Wish細(xì)胞-VSV病毒系統(tǒng)對(duì)目的蛋白的表達(dá)水平及抗病毒活性進(jìn)行了測(cè)定，表達(dá)量和比活分別是300mg/L和1.1×107IU/mg。搖瓶條件下，通過(guò)對(duì)甲醇誘導(dǎo)濃度及誘導(dǎo)起始OD600值兩因素對(duì)轉(zhuǎn)化子表達(dá)水平的影響的初步研究，我們發(fā)現(xiàn)：在0.5％～4.0％的范圍，隨著甲醇誘導(dǎo)濃度的升高蛋白表