重組畢赤酵母遺傳穩(wěn)定性的研究及其表達產物豬α干擾素的分離與純化.pdf

1、本研究分為兩部分，第一部分圍繞與重組菌遺傳穩(wěn)定性相關的指標進行了研究，包括提取酵母基因組進行PCR鑒定、菌體生長狀況（OD600）及蛋白表達量，同時研究了不同溫度對表達過程中蛋白穩(wěn)定性的影響。實驗通過對本實驗室構建的重組體畢赤酵母（外源基因PoIFN-a、宿主細胞KM71H、表達載體pPICZαA）進行了50次的搖瓶傳代，以及在生長相的培養(yǎng)和誘導相的表達來獲得了宿主菌菌體生長情況（OD600）和蛋白表達量的數(shù)據(jù)，以這兩個指標為依據(jù)從外在

2、方面初步判斷菌種活力及目的基因是否存在。結果表明，不管是原始保存的菌株（S）還是經多次發(fā)酵表達后的菌株（N）在經過一個適應階段后生長情況都趨于穩(wěn)定，其中多次發(fā)酵后的菌體OD600大多在10～22之間，原始菌株OD600在19～25之間，前者比后者略低但差異不明顯（P>0.05），表明菌種活力良好。蛋白表達方面，兩組菌種在搖瓶條件下蛋白表達量都約為1g/L左右，經SDS-PAGE電泳和銀染染色證實目的蛋白主要在16KD左右。為使實驗結果具

3、有可靠性，實驗提取了不同代次酵母基因組DNA，PCR擴增后電泳條帶大小和預期相同，測序證明確實為目的基因，從而證明目的基因（PoIFN-α）在體內穩(wěn)定存在。最后為確定不同溫度及表面活性劑對蛋白穩(wěn)定性的影響，實驗設計了兩個不同誘導溫度（20℃和30℃）作為比較，結果表明20℃誘導條件下目標蛋白主要以完整（21KD）和降解形式存在，30℃條件下以降解形式存在，濃度測定結果表明前者約是后者的兩倍，證實溫度是影響蛋白表達穩(wěn)定性的關鍵因素，降低溫

4、度不僅能有效抑制蛋白的降解而且可提高表達量。
　　 第二部分對5L發(fā)酵罐發(fā)酵后的上清進行了分離純化，分別采取了PEG6000沉淀法粗提取和Sephadex G-50凝膠過濾精細提取。前者采用正交實驗設計3因素3水平，處理后目的蛋白絕大部分都能沉淀出來，通過離心即可達到與雜蛋白分離的目的，回收率接近80％，從極差（E）分析來看，對回收率影響最大的因素為pH值和PEG6000濃度，實驗發(fā)現(xiàn)對蛋白的分離只能在弱酸性條件下進行，中性及堿

5、性條件下蛋白變性為白色不溶性沉淀，PEG6000濃度為0.1g/ml時分離效果較好，較大的濃度影響沉淀與上清的分離效果，因此實驗確定的最佳分離條件為pH6.0、NaCl0.2mol/1、PEG60000.1g/ml。由于本實驗采用畢赤酵母表達系統(tǒng)，上清中的雜蛋白少，且與目的蛋白分子量相差較大，將發(fā)酵液離心后經過最大分辨率為30KD的Sephadex16/40凝膠柱后經電泳鑒定達到分離的目的，回收率在60％左右，純度達到90％。