TIP30基因?qū)戆└伟┠退幖癊MT的作用研究.pdf

1、喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在我國約占全身腫瘤的1％-2%，占耳鼻咽喉惡性腫瘤的11%～22%，化療是重要的治療手段之一，近年來根據(jù)NCCN(National Comprehensive Cancer Network美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò))制定的標(biāo)準(zhǔn)化療治療方案未能明顯提高其5年生存率，其重要因素之一就是腫瘤發(fā)生了耐藥性，最終導(dǎo)致了治療的失敗。肝癌是第三大腫瘤殺手，2000年約有548，600人死于肝癌，是我國最常見的惡性腫

2、瘤之一，在我國腫瘤死因排名中位列第2。雖然目前肝癌早期的診斷率有所提高，但由于早期肝癌臨床癥狀不明顯，臨床上發(fā)現(xiàn)時已至晚期，且由于肝臟是全身血供及淋巴管最為豐富的臟器，腫瘤極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，這是肝癌預(yù)后較差的主要原因之一。為提高上述兩種腫瘤的臨床治療效果，有必要對其轉(zhuǎn)移及耐藥的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，為其診斷和治療提供新靶點、新策略。
　　TIP30，又稱CC3，是30kd的轉(zhuǎn)錄輔助因子，最早發(fā)現(xiàn)于肺癌，是利用RNA差異顯示技術(shù)比較高轉(zhuǎn)

3、移性和低轉(zhuǎn)移腫瘤的時發(fā)現(xiàn)的抑癌基因。在正常組織中TIP30均有一定的表達(dá)量，而在腫瘤組織中表達(dá)相對較低，如胰腺癌、惡性黑色素瘤、肺癌、結(jié)腸癌及肝癌等腫瘤中TIP30表達(dá)均顯著下調(diào)。因其有絲／蘇氨酸激酶的活性，RNA聚合酶Ⅱ最大亞基可以和TIP30結(jié)合并被其磷酸化C末端的七肽基序，在一定的微環(huán)境下調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖、凋亡等相關(guān)基因的表達(dá)，與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。
　　過表達(dá)TIP30可抑制腫瘤血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)降解、降低細(xì)胞的

4、侵襲和遷移能力，此外TIP30還可與ETS1蛋白N端相互作用，調(diào)控骨橋蛋白轉(zhuǎn)錄，抑制其表達(dá)，從而調(diào)控肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。新近研究表明TIP30可作為索菲拉尼及microRNA-10b的靶基因，實現(xiàn)其對腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的調(diào)控。在腫瘤細(xì)胞中，TIP30基因往往呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，致使TIP30表達(dá)下降，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生了侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，在肝癌細(xì)胞中TIP30可以通過調(diào)控凋亡相關(guān)基因BCL-2的表達(dá)增加化療效果，提高化療藥物氟尿嘧啶對腫瘤的殺傷力，延

5、長動物帶瘤生存的時間。上述研究均提示TIP30在腫瘤細(xì)胞中具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，提高化療敏感性的作用，但是在喉癌中TIP30的具體作用仍為見相關(guān)文獻(xiàn)報道，且TIP30調(diào)控轉(zhuǎn)移及耐藥的具體作用機(jī)制仍然有待于我們進(jìn)一步深入的研究。
　　利用免疫組化技術(shù)，我們檢測了104例喉癌病人的腫瘤及癌旁組織中TIP30的蛋白表達(dá)情況，分析了多項臨床指標(biāo)與TIP30蛋白質(zhì)表達(dá)的相關(guān)性，通過動物模型成功獲得了了喉癌耐藥細(xì)胞株DSCs，并在此基礎(chǔ)上對TIP

6、30調(diào)控喉癌及肝癌耐藥及EMT的生物學(xué)功能進(jìn)行了進(jìn)一步研究。
　　第一部分 TIP30在喉癌組織中的表達(dá)及與臨床指標(biāo)的關(guān)系
　　采用Envision法檢測TIP30在104例喉癌及癌旁組織中表達(dá)情況，按照免疫組化評分的標(biāo)準(zhǔn)，將組織中TIP30的表達(dá)分為兩組：高表達(dá)和低表達(dá)組。TIP30蛋白呈棕黃色顆粒分在胞漿及胞核中均有著色，但以胞漿為主。在104例病人中，79例中TIP30呈低表達(dá)，25例病人呈高表達(dá)。利用分層分析法檢驗了

7、TIP30、性別、年齡、臨床分期、分化程度與患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示TIP30的表達(dá)與喉癌病人的預(yù)后密切相關(guān)（p＜0.001）。Kaplan–Meier生存曲線分析TIP30蛋白表達(dá)量與喉癌患者總體生存率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)TIP30的表達(dá)與喉癌患者預(yù)后關(guān)系密切相關(guān)，TIP30高表達(dá)的患者生存時間明顯高于低表達(dá)患者。
　　第二部分 RNA-Seq分析TIP30基因表達(dá)在頭頸部鱗癌中與細(xì)胞化藥耐藥的關(guān)系以及體內(nèi)藥物篩選喉癌耐藥細(xì)胞株（DSC

8、s）的功能鑒定及TIP30在DSCs中的表達(dá)
　　利用RNA-Seq高通量數(shù)據(jù)結(jié)合11株頭頸部鱗狀細(xì)胞癌化藥敏感性的結(jié)果，分析TIP30基因與頭頸部鱗癌細(xì)胞化藥耐藥的關(guān)系。結(jié)果顯示在11株頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中Hep2細(xì)胞及58F細(xì)胞TIP30呈高表達(dá)，其他幾種細(xì)胞表達(dá)基本一致。耐藥實驗中TIP30高表達(dá)的Hep2細(xì)胞及58F細(xì)胞化藥耐藥能力較其他細(xì)胞顯著降低，提示TIP30基因的表達(dá)可能與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的耐藥密切相關(guān)。我們進(jìn)一步采

9、用順鉑體內(nèi)給藥的方法獲得喉癌耐藥細(xì)胞株DSCs。通過RT-PCR檢測了DSCs耐藥基因ABCG2,ABCC2,ABCB1的表達(dá)；體外耐藥實驗檢測其耐藥性變化；RT-PCR檢測自我更新相關(guān)基因Bmi1，Oct4，Nanog的表達(dá)變化；懸浮成球?qū)嶒灆z測其成球及自我更新能力的變化；克隆形成實驗檢測其增殖能力的變化；有限稀釋成瘤檢測其致瘤性能力的變化；免疫組化及qRT-PCR法檢測TIP30的表達(dá)變化。DSCs較親本喉癌細(xì)胞株Hep2具有更強的

10、耐藥、增殖、自我更新及致瘤能力，同時在DSCs中TIP30幾乎不表達(dá)。
　　第三部分 TIP30對喉癌及肝癌耐藥、轉(zhuǎn)移作用的研究
　　在肝癌及喉癌中根據(jù)內(nèi)源性TIP30的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)干預(yù)，進(jìn)行如下實驗：過RT-PCR檢測了其耐藥基因ABCG2,ABCC2,ABCB1的表達(dá)；體外耐藥實驗檢測其耐藥性變化；RT-PCR檢測自我更新相關(guān)基因Bmi1，Oct4，Nanog的表達(dá)變化；懸浮成球?qū)嶒灆z測其成球及自我更新能力的變化；克隆形

11、成實驗檢測其增殖能力的變化；有限稀釋成瘤檢測其致瘤性能力的變化；裸鼠荷瘤生存時間變化；成瘤體積大小的變化；腫瘤局部浸潤的變化；免疫熒光及Western法檢測EMT相關(guān)Marker的表達(dá)變化；結(jié)果顯示：干擾TIP30的表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞具有更強的耐藥、增殖、自我更新、致瘤能力，且導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)換。過表達(dá)TIP30后腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性增加，增殖、自我更新及致瘤能力減弱，且使得腫瘤細(xì)胞上皮表型標(biāo)志物顯著增加，間充質(zhì)表型標(biāo)志物顯著

12、降低。
　　第四部分 TIP30調(diào)控喉癌及肝癌細(xì)胞耐藥及轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究
　　在喉癌及肝癌細(xì)胞中干預(yù)TIP30的表達(dá)后，利用RT-PCR、Western-blot，免疫熒光等方法檢測GSK3β/β-Catenin信號通路關(guān)鍵分子GSK3β，β-Catenin及EMT轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)及定位變化。共轉(zhuǎn)染干預(yù)TIP30的慢病毒及β-Catenin、Snail的過表達(dá)質(zhì)粒或小干擾Rna，觀察細(xì)胞耐藥能力及EMT相關(guān)指標(biāo)的變化情

13、況。染色質(zhì)免疫共沉淀方法檢測TIP30與核轉(zhuǎn)運因子importin-β的結(jié)合情況及其對Snail核定位影響。結(jié)果提示：干擾TIP30的表達(dá)后GSK3β磷酸化程度增高，β-Catenin磷酸化程度下降，GSK3β/β-Catenin信號通路異常激活，而過表達(dá)TIP30后GSK3β/β-Catenin信號通路活性受到抑制，TIP30可與Snail競爭結(jié)合importin-β抑制Snail的入核。
　　1.TIP30在喉癌中的表達(dá)水平與

14、喉鱗狀細(xì)胞癌患者的預(yù)后及臨床分期密切相關(guān)，TIP30高表達(dá)的喉癌患者預(yù)后較好，TIP30可以作為一個判斷喉鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)。
　　2.RNA-Seq高通量數(shù)據(jù)結(jié)合11株頭頸部鱗狀細(xì)胞癌分析結(jié)果顯示TIP30基因表達(dá)與頭頸部鱗癌的化藥耐藥相關(guān)。通過體內(nèi)給藥的動物模型，可以成功獲得喉鱗狀細(xì)胞癌耐藥細(xì)胞株DSCs，與親本細(xì)胞株Hep2比較，DSCs細(xì)胞具有更強的增殖、成瘤、耐藥能力，且TIP30呈低表達(dá)，為喉癌耐藥的進(jìn)一步研

15、究奠定了基礎(chǔ)。
　　3.TIP30能調(diào)控腫瘤細(xì)胞的耐藥性，過表達(dá)TIP30可以增加化療藥物的作用，延長小鼠帶瘤生存的時間。
　　4.TIP30能調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移，并能調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移早期事件EMT的進(jìn)程，過表達(dá)TIP30能抑制EMT及腫瘤轉(zhuǎn)移，敲除TIP30能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT進(jìn)程的發(fā)生致使腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。
　　5.TIP30能調(diào)控信號通路GSK3β/β-Catenin的活性，并通過該通路調(diào)控腫瘤的耐藥性。