血管內(nèi)皮生長因子在胚胎成骨細胞中的表達研究及應用.pdf

1、目的：對含有血管內(nèi)皮生長因子VEGF基因片段的胚胎成骨細胞進行細胞培養(yǎng)體外擴增，觀察轉染后的成骨細胞的增殖功能、及生物學特性變化，再以含有目的基因的成骨細胞為種子細胞，在選定的可吸收材料生物支架的基礎上通過生物膜塑形成預先設定的三維立體形狀，將體外培養(yǎng)的軟骨細胞種植于其表面使其相容，構建特定形狀的血管化的復合組織工程人工骨，以期實現(xiàn)從分子水平對骨缺損、骨壞死、骨不連等的治療，為臨床治療骨壞死等醫(yī)學界棘手問題提供一種嶄新的理論基礎和治療方

2、法。 現(xiàn)在臨床工作中各種原因引起的骨壞死病例日漸增多，且有種類較多，逐漸趨于年輕化、復雜化的趨勢。目前臨床上常用的治療骨壞死的方法有：死骨摘除假體填塞，假體置換，帶蒂骨瓣移植，中藥保守治療等等，這些療法往往損傷較大但效果卻不甚理想，病人的運動和感覺功能恢復常令人不甚滿意。甚至有可能造成終身病廢。因此本課題設計志在通過使用現(xiàn)代分子生物學技術，以VEGF基因片段(ad5-h-VEGF)為目的基因，結合人的5型腺病毒，構件含有目的基因

3、的腺病毒載體，將剛出生的胎鼠(SD大鼠)胚胎成骨細胞進行體外培養(yǎng)擴增，當細胞增殖到對數(shù)增長期時，以此期的細胞為靶細胞進行體外轉染，使轉染的成骨細胞既保持其自身的增殖能力，又通過其表達的VEGF促進血管再生，這樣既解決了骨質再生問題又解決了缺乏血運的難題。而且經(jīng)實驗研究已經(jīng)證實VEGF還有促進骨化的作用。通過免疫組化和免疫熒光、細胞流式方法等檢測其表達，通過細胞增殖實驗(描繪其轉染前后的生長曲線)等了解目的基因轉染后成骨細胞其生物學活性及

4、增殖功能變化，靶細胞基因修飾表達成功以后移植體內(nèi)，觀察移植物血管化進程和轉染成骨細胞的增殖功能，為以后種植在具有良好組織相容性及可降解性的生物支架以及生物膜塑形，外覆體外培養(yǎng)的軟骨細胞構建血管化的組織工程骨，通過對比觀察骨缺損實驗動物模型的內(nèi)環(huán)境及各種應力的作用下的組織工程骨的生物學情況，期望得出該方法是治療臨床各種骨壞死的可行的有效的理想的仿生學治療方法。為臨床治療骨壞死提供一種新的突破性的治療方法與理念。方法：胎鼠顱蓋骨取成骨細胞作

5、原代培養(yǎng)，將成骨細胞置于37℃，飽和濕度5％CO2的常規(guī)條件下培養(yǎng)，待細胞進入對數(shù)生長期后用于實驗。 1.細胞培養(yǎng)：取剛產(chǎn)下的SD大鼠的胎鼠，放入75％的酒精中浸泡5分鐘。四肢固定于蠟盤上。切開顱定皮膚暴露并取下顱蓋骨，盡量剔除干凈殘存的骨膜及軟組織，Hanks液浸泡沖洗，使用胰酶及II型膠原酶雙酶消化法消化30min，消化處理后的顱蓋骨，Hanks液浸泡沖洗，將消化后的顱蓋骨在瓶皿中剪成約1mm3的組織塊，在DMEM中貼壁培養(yǎng)

6、，每日再倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。 2.成骨細胞鑒定及檢測技術，包括形態(tài)學觀察(成骨細胞掃描電鏡觀察)，吉姆薩染色法，堿性磷酸酶(ALP)，甲苯胺藍染色法，礦化結節(jié)染色(茜素紅染色)等方法鑒別。 3.構建含有VEGF基因片段(ad5-h-VEGF)的人5型腺病毒載體，將胚胎成骨細胞進行體外培養(yǎng)擴增傳代，以進入對數(shù)生長期的成骨細胞為靶細胞進行轉染，測繪轉染前后各自生長曲線。免疫組化染色及免疫熒光定性分析轉染后目的基因在

7、靶細胞中的表達情況。并通過流式細胞技術定量檢測成骨細胞中的目的基因轉染率。 結果： 1.成骨細胞的培養(yǎng)及觀察培養(yǎng)的原代成骨細胞約5-7天爬滿培養(yǎng)瓶，倒置顯微鏡下觀察生長期貼壁后的成骨細胞多呈梭形或三角形或多角形，圓形或橢圓形的細胞核居中或偏于細胞一側，有較多突起，單核或1-3個核仁，胞質豐富、清晰。生長期細胞分裂相多見，細胞突起相互聯(lián)接。細胞表面有數(shù)量不等、長短不一的突起伸出，細胞呈集落化生長趨勢可復層生長，形成細胞結節(jié)

8、甚至團塊狀。 2.掃描電鏡下可見成骨細胞有多個突起，表面較多突起，形態(tài)飽滿。細胞間由突起互相聯(lián)接。 3.堿性磷酸酶(ALP)染色(Gomori鈣鈷法)，成骨細胞胞質中呈現(xiàn)灰黑色顆?；驂K狀沉淀。 4 礦化結節(jié)染色(茜素紅法)后，肉眼見礦化結節(jié)呈現(xiàn)不同的紅色團塊。 5 Giemsa染色法，見胞漿豐富染成粉紅色，細胞核染成紫藍色，成圓形或卵圓形，位于細胞中央或偏向一側，核仁明顯。 6 VEGF轉染前、后

9、細胞生長曲線對照：轉染后成骨細胞的增殖較未轉染的同代空白對照組，在不同的時間段均有增殖增強的趨勢，且一定生長時限后生長均趨于平緩。 7 成骨細胞目的基因轉染后免疫組化染色蘇木精復染后定性分析：以不同感染復數(shù)的Ad5-h-VEGF感染成骨細胞，培養(yǎng)72小時后，對照組細胞細胞即轉染(一)組，細胞核呈紅色，胞漿不顯色。實驗組即轉染(＋)組，轉染細胞細胞核呈紅色，胞漿呈土紅色或棕色。如果沒有蘇木精復染細胞核均不顯色，只是轉染陽性者胞漿顯

10、色土紅色或棕色。 8 成骨細胞目的基因轉染后免疫熒光染色PE復染后定性分析：以不同感染復數(shù)的Ad5-h-VEGF感染成骨細胞，培養(yǎng)72小時后，對照組細胞細胞即轉染(一)組，細胞核呈紅色熒光，胞漿不顯色。實驗組即轉染(＋)組，轉染細胞細胞核呈紅色熒光，胞漿呈淡綠色熒光。 9 以不同感染復數(shù)的Ad5-h-VEGF感染成骨細胞，培養(yǎng)72小時后，流式細胞儀檢測目的基因轉染陽性率，對成骨細胞目的基因轉染做定量分析。 結論：

11、 1.通過雙酶消化，貼壁培養(yǎng)法可得到較純的原代成骨細胞。對培養(yǎng)的成骨細胞可以通過形態(tài)學及生長特性等的觀察進行鑒定，根據(jù)成骨細胞的生化特性可采取堿性磷酸酶(ALP)染色(Gomori鈣鈷法)，礦化結節(jié)染色(茜素紅法)，吉姆薩染色法等加以印證核實。 2.攜帶目的基因一VEGF基因的腺病毒載體即ad5-h-VEGF，可以成功轉染成骨細胞，且轉染效率在一定程度上呈現(xiàn)滴度時間依賴趨勢，轉染的最佳MOI(感染復數(shù))約為45，最佳時間約為轉染