血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在胚胎成骨細(xì)胞中的表達(dá)研究及應(yīng)用.pdf

1、目的：對(duì)含有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF基因片段的胚胎成骨細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)體外擴(kuò)增，觀(guān)察轉(zhuǎn)染后的成骨細(xì)胞的增殖功能、及生物學(xué)特性變化，再以含有目的基因的成骨細(xì)胞為種子細(xì)胞，在選定的可吸收材料生物支架的基礎(chǔ)上通過(guò)生物膜塑形成預(yù)先設(shè)定的三維立體形狀，將體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞種植于其表面使其相容，構(gòu)建特定形狀的血管化的復(fù)合組織工程人工骨，以期實(shí)現(xiàn)從分子水平對(duì)骨缺損、骨壞死、骨不連等的治療，為臨床治療骨壞死等醫(yī)學(xué)界棘手問(wèn)題提供一種嶄新的理論基礎(chǔ)和治療方

2、法。 現(xiàn)在臨床工作中各種原因引起的骨壞死病例日漸增多，且有種類(lèi)較多，逐漸趨于年輕化、復(fù)雜化的趨勢(shì)。目前臨床上常用的治療骨壞死的方法有：死骨摘除假體填塞，假體置換，帶蒂骨瓣移植，中藥保守治療等等，這些療法往往損傷較大但效果卻不甚理想，病人的運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)功能恢復(fù)常令人不甚滿(mǎn)意。甚至有可能造成終身病廢。因此本課題設(shè)計(jì)志在通過(guò)使用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，以VEGF基因片段(ad5-h-VEGF)為目的基因，結(jié)合人的5型腺病毒，構(gòu)件含有目的基因

3、的腺病毒載體，將剛出生的胎鼠(SD大鼠)胚胎成骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增，當(dāng)細(xì)胞增殖到對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期時(shí)，以此期的細(xì)胞為靶細(xì)胞進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染，使轉(zhuǎn)染的成骨細(xì)胞既保持其自身的增殖能力，又通過(guò)其表達(dá)的VEGF促進(jìn)血管再生，這樣既解決了骨質(zhì)再生問(wèn)題又解決了缺乏血運(yùn)的難題。而且經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)VEGF還有促進(jìn)骨化的作用。通過(guò)免疫組化和免疫熒光、細(xì)胞流式方法等檢測(cè)其表達(dá)，通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(描繪其轉(zhuǎn)染前后的生長(zhǎng)曲線(xiàn))等了解目的基因轉(zhuǎn)染后成骨細(xì)胞其生物學(xué)活性及

4、增殖功能變化，靶細(xì)胞基因修飾表達(dá)成功以后移植體內(nèi)，觀(guān)察移植物血管化進(jìn)程和轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞的增殖功能，為以后種植在具有良好組織相容性及可降解性的生物支架以及生物膜塑形，外覆體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞構(gòu)建血管化的組織工程骨，通過(guò)對(duì)比觀(guān)察骨缺損實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的內(nèi)環(huán)境及各種應(yīng)力的作用下的組織工程骨的生物學(xué)情況，期望得出該方法是治療臨床各種骨壞死的可行的有效的理想的仿生學(xué)治療方法。為臨床治療骨壞死提供一種新的突破性的治療方法與理念。方法：胎鼠顱蓋骨取成骨細(xì)胞作

5、原代培養(yǎng)，將成骨細(xì)胞置于37℃，飽和濕度5％CO2的常規(guī)條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用于實(shí)驗(yàn)。 1.細(xì)胞培養(yǎng)：取剛產(chǎn)下的SD大鼠的胎鼠，放入75％的酒精中浸泡5分鐘。四肢固定于蠟盤(pán)上。切開(kāi)顱定皮膚暴露并取下顱蓋骨，盡量剔除干凈殘存的骨膜及軟組織，Hanks液浸泡沖洗，使用胰酶及II型膠原酶雙酶消化法消化30min，消化處理后的顱蓋骨，Hanks液浸泡沖洗，將消化后的顱蓋骨在瓶皿中剪成約1mm3的組織塊，在DMEM中貼壁培養(yǎng)

6、，每日再倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。 2.成骨細(xì)胞鑒定及檢測(cè)技術(shù)，包括形態(tài)學(xué)觀(guān)察(成骨細(xì)胞掃描電鏡觀(guān)察)，吉姆薩染色法，堿性磷酸酶(ALP)，甲苯胺藍(lán)染色法，礦化結(jié)節(jié)染色(茜素紅染色)等方法鑒別。 3.構(gòu)建含有VEGF基因片段(ad5-h-VEGF)的人5型腺病毒載體，將胚胎成骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增傳代，以進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成骨細(xì)胞為靶細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，測(cè)繪轉(zhuǎn)染前后各自生長(zhǎng)曲線(xiàn)。免疫組化染色及免疫熒光定性分析轉(zhuǎn)染后目的基因在

7、靶細(xì)胞中的表達(dá)情況。并通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)定量檢測(cè)成骨細(xì)胞中的目的基因轉(zhuǎn)染率。 結(jié)果： 1.成骨細(xì)胞的培養(yǎng)及觀(guān)察培養(yǎng)的原代成骨細(xì)胞約5-7天爬滿(mǎn)培養(yǎng)瓶，倒置顯微鏡下觀(guān)察生長(zhǎng)期貼壁后的成骨細(xì)胞多呈梭形或三角形或多角形，圓形或橢圓形的細(xì)胞核居中或偏于細(xì)胞一側(cè)，有較多突起，單核或1-3個(gè)核仁，胞質(zhì)豐富、清晰。生長(zhǎng)期細(xì)胞分裂相多見(jiàn)，細(xì)胞突起相互聯(lián)接。細(xì)胞表面有數(shù)量不等、長(zhǎng)短不一的突起伸出，細(xì)胞呈集落化生長(zhǎng)趨勢(shì)可復(fù)層生長(zhǎng)，形成細(xì)胞結(jié)節(jié)

8、甚至團(tuán)塊狀。 2.掃描電鏡下可見(jiàn)成骨細(xì)胞有多個(gè)突起，表面較多突起，形態(tài)飽滿(mǎn)。細(xì)胞間由突起互相聯(lián)接。 3.堿性磷酸酶(ALP)染色(Gomori鈣鈷法)，成骨細(xì)胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)灰黑色顆?；驂K狀沉淀。 4 礦化結(jié)節(jié)染色(茜素紅法)后，肉眼見(jiàn)礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)不同的紅色團(tuán)塊。 5 Giemsa染色法，見(jiàn)胞漿豐富染成粉紅色，細(xì)胞核染成紫藍(lán)色，成圓形或卵圓形，位于細(xì)胞中央或偏向一側(cè)，核仁明顯。 6 VEGF轉(zhuǎn)染前、后

9、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)對(duì)照：轉(zhuǎn)染后成骨細(xì)胞的增殖較未轉(zhuǎn)染的同代空白對(duì)照組，在不同的時(shí)間段均有增殖增強(qiáng)的趨勢(shì)，且一定生長(zhǎng)時(shí)限后生長(zhǎng)均趨于平緩。 7 成骨細(xì)胞目的基因轉(zhuǎn)染后免疫組化染色蘇木精復(fù)染后定性分析：以不同感染復(fù)數(shù)的Ad5-h-VEGF感染成骨細(xì)胞，培養(yǎng)72小時(shí)后，對(duì)照組細(xì)胞細(xì)胞即轉(zhuǎn)染(一)組，細(xì)胞核呈紅色，胞漿不顯色。實(shí)驗(yàn)組即轉(zhuǎn)染(＋)組，轉(zhuǎn)染細(xì)胞細(xì)胞核呈紅色，胞漿呈土紅色或棕色。如果沒(méi)有蘇木精復(fù)染細(xì)胞核均不顯色，只是轉(zhuǎn)染陽(yáng)性者胞漿顯

10、色土紅色或棕色。 8 成骨細(xì)胞目的基因轉(zhuǎn)染后免疫熒光染色PE復(fù)染后定性分析：以不同感染復(fù)數(shù)的Ad5-h-VEGF感染成骨細(xì)胞，培養(yǎng)72小時(shí)后，對(duì)照組細(xì)胞細(xì)胞即轉(zhuǎn)染(一)組，細(xì)胞核呈紅色熒光，胞漿不顯色。實(shí)驗(yàn)組即轉(zhuǎn)染(＋)組，轉(zhuǎn)染細(xì)胞細(xì)胞核呈紅色熒光，胞漿呈淡綠色熒光。 9 以不同感染復(fù)數(shù)的Ad5-h-VEGF感染成骨細(xì)胞，培養(yǎng)72小時(shí)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)目的基因轉(zhuǎn)染陽(yáng)性率，對(duì)成骨細(xì)胞目的基因轉(zhuǎn)染做定量分析。 結(jié)論：

11、 1.通過(guò)雙酶消化，貼壁培養(yǎng)法可得到較純的原代成骨細(xì)胞。對(duì)培養(yǎng)的成骨細(xì)胞可以通過(guò)形態(tài)學(xué)及生長(zhǎng)特性等的觀(guān)察進(jìn)行鑒定，根據(jù)成骨細(xì)胞的生化特性可采取堿性磷酸酶(ALP)染色(Gomori鈣鈷法)，礦化結(jié)節(jié)染色(茜素紅法)，吉姆薩染色法等加以印證核實(shí)。 2.攜帶目的基因一VEGF基因的腺病毒載體即ad5-h-VEGF，可以成功轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞，且轉(zhuǎn)染效率在一定程度上呈現(xiàn)滴度時(shí)間依賴(lài)趨勢(shì)，轉(zhuǎn)染的最佳MOI(感染復(fù)數(shù))約為45，最佳時(shí)間約為轉(zhuǎn)染