固體健腦法對(duì)老年健忘模型大鼠作用的理論及實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：建立老年健忘大鼠模型。分別按照補(bǔ)脾、補(bǔ)腎和固本(補(bǔ)脾腎)三種治療原則，選擇藥物作用于模型動(dòng)物，觀察給藥后動(dòng)物記憶功能的改變，從功能、細(xì)胞、分子水平詮釋固本健腦法改善記憶的作用機(jī)理。依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，闡釋“固本一健腦”理論的科學(xué)內(nèi)涵，明確老年健忘與中醫(yī)脾腎的關(guān)系，探討老年健忘的中醫(yī)病因病機(jī)，為尋求中醫(yī)改善記憶的方藥提供依據(jù)，為中醫(yī)藥防治腦機(jī)能退化做初步探索，豐富和補(bǔ)充中醫(yī)脾腎理論的內(nèi)容。 方法：采用文獻(xiàn)研究的方法，對(duì)古代醫(yī)家關(guān)于

2、健忘的理論探討進(jìn)行系統(tǒng)回顧，從文獻(xiàn)中找出先賢對(duì)健忘的認(rèn)識(shí)，深入探討記憶的生理基礎(chǔ)和健忘的病理機(jī)制，按照中醫(yī)理論，進(jìn)一步總結(jié)出健忘的病因病機(jī)。 結(jié)合導(dǎo)師組治療老年健忘的經(jīng)驗(yàn)，依據(jù)從古今文獻(xiàn)中總結(jié)出的健忘的病因病機(jī)理論，篩選藥物組成補(bǔ)脾健腦方(黨參、茯苓、山楂、石菖蒲等)、補(bǔ)腎健腦方(杞果、何首烏、山楂、石菖蒲等)和固本健腦方(黨參、杞果、何首烏、茯苓、山楂、石菖蒲等)，以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方式驗(yàn)證該病因病機(jī)理論的科學(xué)性。 課題組前

3、期的研究結(jié)果已證實(shí)固本健腦方可以改善記憶，但對(duì)其產(chǎn)生療效的分子機(jī)制和補(bǔ)脾與補(bǔ)腎的療效差異，沒(méi)有做深入研究。為明確脾腎影響記憶的具體環(huán)節(jié)，又將該方拆方為補(bǔ)脾健腦方和補(bǔ)腎健腦方，與固本健腦方一起分別作用于模型動(dòng)物，觀察其產(chǎn)生療效的機(jī)制。從功能、細(xì)胞、分子等不同層次揭示3種療法產(chǎn)生療效的具體機(jī)制。 用跳臺(tái)法篩選記憶能力相當(dāng)?shù)膭?dòng)物，隨機(jī)分為正常組和模型組。正常組15只，模型組60只。正常組每天腹腔注射生理鹽水2ml，模型組腹腔注射D-半

4、乳糖和NaNO2，連續(xù)40天，以復(fù)制老年健忘動(dòng)物模型。造模結(jié)束后，以跳臺(tái)法和morrise水迷宮法檢測(cè)造模結(jié)果。將造模成功后的模型組動(dòng)物，按照完全隨機(jī)法再分為補(bǔ)脾組、補(bǔ)腎組、固本組和模型組，每組15只。與正常組一起，使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物總數(shù)達(dá)到5組，75只。 正常組和模型組動(dòng)物每天灌胃生理鹽水2ml，其余3個(gè)治療組分別以補(bǔ)脾健腦方、補(bǔ)腎健腦方和固本健腦方水煎液灌胃。按照人與動(dòng)物體表面積折算法，算得大鼠等效劑量分別為每公斤體重50g(固本健

5、腦方)生藥、40g生藥(補(bǔ)脾健腦方、補(bǔ)腎健腦方)。濃縮各方藥液使每毫升藥液含生藥2g，每次灌胃2ml，連續(xù)20天。 灌胃結(jié)束后，進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)束后，各組動(dòng)物禁食12h，1-10 號(hào)動(dòng)物斷頭取血，3000r·min-1離心10min，取血清按試劑盒說(shuō)明書(shū)中方法，測(cè)定SOD的活力和MDA的含量。取大腦皮層檢測(cè)Na+-K+-ATP酶活性；取左側(cè)海馬檢測(cè)C-FOS基因表達(dá)；取右側(cè)海馬檢測(cè)谷氨酸受體NR2A基因表達(dá)。 11

6、～15號(hào)大鼠，行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，取鼠腦固定后，常規(guī)方法進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3(NT-3)和HSP70表達(dá)。 結(jié)果：造模結(jié)束后，模型組動(dòng)物皮毛干枯、稀疏、脫落，目眵增多，活動(dòng)量減少，生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，精神萎靡，飲水量、進(jìn)食量明顯少于正常組，表現(xiàn)出明顯的衰老狀態(tài)，符合衰老動(dòng)物的特征。給藥結(jié)束后，跳臺(tái)法檢測(cè)，正常組潛伏期明顯高于模型組(P<0.01)，補(bǔ)腎組、固本組成績(jī)高于模型組(P<0.01)。5

7、分鐘內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)檢測(cè)，補(bǔ)脾組、補(bǔ)腎組和固本組均低于模型組(P<0.01或P<0.05)。固本組動(dòng)物成績(jī)優(yōu)于補(bǔ)脾組(P<0.05)和補(bǔ)腎組(P<0.01)。Morrise水迷宮法檢測(cè)，模型組動(dòng)物找到隱匿平臺(tái)的時(shí)間明顯長(zhǎng)于正常組(P<0.01)。3個(gè)治療組的動(dòng)物找到平臺(tái)的時(shí)間均低于模型組，其中固本組療效最好，基本接近正常組(P>0.05)。 平臺(tái)撤除后，正常組和各給藥組動(dòng)物穿越平臺(tái)的次數(shù)均明顯高于模型組(P<0.01或P<0.05)。

8、固本組療效明顯優(yōu)于補(bǔ)脾組(P<0.01)和補(bǔ)腎組(P<0.05)，與正常組比較P>0.05。與正常組比較，模型組動(dòng)物在平臺(tái)所在象限(C區(qū))的游泳時(shí)間明顯減少(P<0.01)。各給藥組動(dòng)物C區(qū)游泳時(shí)間均高于模型組(P<0.01或P<0.05)，固本組療效優(yōu)于補(bǔ)脾組和補(bǔ)腎組(P<0.01)。 模型組動(dòng)物血清SOD活性明顯低于正常組(P<0.01)，固本組明顯高于模型組(P<0.05)。模型組動(dòng)物血清MDA含量明顯高于正常組(P<0.

9、01)，各給藥組MDA含量有不同程度降低，但3組之間的差異無(wú)意義。 模型組動(dòng)物大腦皮層Na+-K+ATP酶活性比正常組極顯著降低(P<0.01)；補(bǔ)脾組和固本組活性均高于模型組(P<0.01或P<0.05)． 正常組、補(bǔ)脾組、固本組NGF陽(yáng)性表達(dá)均明顯高于模型組(P<0.01或P<0.05)，補(bǔ)腎組NGF表達(dá)明顯低于固本組(P<0.05)。正常組NT-3免疫陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞灰度值均明顯高于模型組(P<0.05)

10、，與NGF檢測(cè)結(jié)果一致。 正常組大鼠腦內(nèi)未見(jiàn)HSP70免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞。各治療組動(dòng)物海馬腦區(qū)HSP70免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均高于模型組(P<0.01)，以固本組療效最佳，其HSF70免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于補(bǔ)脾和補(bǔ)腎組(P<0.01)。正常組c-fosmRNA表達(dá)低于模型組(P<0.01)，3個(gè)治療組均高于模型組(P<0.01)，固本組明顯高于補(bǔ)腎組(P<0.05)，但和補(bǔ)脾組比較差異無(wú)意義(P>0.05)。 正常組動(dòng)物海馬有一

11、定量的NR2AmRNA表達(dá)，明顯高于模型組(P<0.05)，補(bǔ)腎組和固本組NR2AmRNA表達(dá)較模型組明顯增高(P<0.01)，其中固本組療效最好，明顯高于正常組(P<0.01)。 結(jié)論：綜合以上研究結(jié)果課題組認(rèn)為，老年健忘是一個(gè)病變涉及多個(gè)臟腑，又與氣血痰濁密切相關(guān)的綜合性復(fù)雜病癥，但其中心環(huán)節(jié)是脾腎二臟。糾正了脾腎的虧損，就解決了病變的關(guān)鍵。聯(lián)合使用D-半乳糖與亞硝酸鈉腹腔注射，可以較好復(fù)制老年健忘動(dòng)物模型。固本健腦法可以通