體外誘導(dǎo)hUC-MSCs分化的微生物代謝物篩選及分離鑒定研究.pdf

1、微生物代謝產(chǎn)物種類(lèi)繁多,代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣,為新藥的研發(fā)提供了豐富的資源。近幾年,盡管微生物代謝產(chǎn)物的研究取得到了快速的發(fā)展,越來(lái)越多的結(jié)構(gòu)新穎、功能多樣的新活性物質(zhì)被發(fā)現(xiàn),但大部分代謝產(chǎn)物的活性評(píng)價(jià)指標(biāo)仍?xún)H局限于抗腫瘤活性的研究上,而相對(duì)忽略了其他活性指標(biāo)的研究。因此,本課題嘗試從放線(xiàn)菌代謝產(chǎn)物庫(kù)中篩選出能夠誘導(dǎo)hUC-MSCs向成脂或成骨分化的活性物質(zhì),以期獲得結(jié)構(gòu)新穎、活性較高的先導(dǎo)化合物。
　　本文對(duì)本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存的40

2、0多株放線(xiàn)菌代謝產(chǎn)物進(jìn)行體外活性篩選實(shí)驗(yàn),篩選具有能夠誘導(dǎo)hUC-MSCs成脂或成骨分化的代謝產(chǎn)物,整個(gè)篩選實(shí)驗(yàn)建立在細(xì)胞水平的基礎(chǔ)上,以96孔板為篩選平臺(tái),采用代謝提取物與細(xì)胞共培養(yǎng)的方式,觀察代謝提取物對(duì)細(xì)胞分化的影響,并通過(guò)油紅染色和堿性磷酸酶染色分別鑒定hUC-MSCs成脂或成骨分化的形成。結(jié)果,從400多株放線(xiàn)菌代謝產(chǎn)物中篩選到了具有誘導(dǎo)hUC-MSCs成脂和成骨分化的代謝產(chǎn)物,其中,一株放線(xiàn)菌代謝產(chǎn)物具有明顯誘導(dǎo)hUC-MS

3、Cs成脂分化的作用,該菌株編號(hào)為3418。
　　為確定3418放線(xiàn)菌代謝產(chǎn)物中的有效成分,需對(duì)該菌株進(jìn)行較大量發(fā)酵,以確保得到一定量的菌體發(fā)酵產(chǎn)物。采用發(fā)酵罐發(fā)酵的方式,對(duì)3418菌株進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵體積為30L,同時(shí)對(duì)發(fā)酵菌體進(jìn)行OD600值、濕重及還原糖含量的測(cè)定,以確保菌體在發(fā)酵過(guò)程中的穩(wěn)定性。
　　采用溶劑法對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行粗提取,并通過(guò)細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn),確定了活性部位。再通過(guò)活性跟蹤分離的方法,對(duì)活性部位中的有效成分進(jìn)行分

4、離純化。采用正相硅膠色譜柱層析、SephadexLH-20凝膠色譜柱層析以及薄層制備等分離手段,共分離得到8個(gè)單體化合物,一個(gè)化合物為新化合物。同時(shí),結(jié)合TLC分析,初步判定其中一個(gè)化合物具有誘導(dǎo)hUC-MSCs成脂分化的活性。
　　利用1H-NMR,13C-NMR,HSQC,HMBC,ESI-MS等結(jié)構(gòu)鑒定方法,對(duì)分離得到的單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,其中5個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)已確定,分別為:尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、十七烷酸、1-(3,