鼻咽癌中EB病毒編碼的miRNAs及其宿主靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和初步驗證.pdf

1、鼻咽癌是一種與EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染密切相關(guān)的鼻咽上皮惡性腫瘤，然而EBV促進鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的確切機制還沒有完全闡明。最近有證據(jù)指出一類由EBV編碼的微小RNA(microRNA，miRNA)分子可能參與了EBV介導的鼻咽上皮惡性轉(zhuǎn)化，從而影響鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。目前已發(fā)現(xiàn)EBV可編碼25個miRNAs前體，加工成44個成熟的miRNAs，且EBV編碼的miRNAs在EBV基因組上成簇分布，可以分為B

2、ART和BHRF1兩組。但鼻咽癌中對于EBV編碼miRNAs的研究還不是很透徹，44個成熟的EBV miRNAs中大部分還沒有功能研究的報道。
　　為了確定EBV編碼的miRNA如何調(diào)控宿主基因的表達，了解EBV miRNA在鼻咽上皮惡性轉(zhuǎn)化中潛在的作用機制，本課題構(gòu)建了鼻咽癌和正常對照組織中EBV編碼的全部44個成熟miRNAs的表達譜;對這些EBV miRNAs和它們潛在的宿主靶基因進行分析，構(gòu)建了EBV miRNA和它們宿主

3、靶基因之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò);最后，從中挑選了EBV miRNAs BART10及其靶基因BTRC進行初步驗證。
　　1、構(gòu)建EBV miRNAs的表達譜通過Real-time PCR技術(shù)檢測了鼻咽癌、正常對照組織及相關(guān)細胞系中EBV編碼的miRNAs表達水平，同時檢測了兩個EBV編碼的蛋白表達基因LMP1和EBNA1以作為參照。所檢測的樣品包括16例鼻咽癌活檢組織（其中臨床TNM分期第Ⅱ期5例，Ⅲ期5例，Ⅳ期6例）、5例正常對照組織（來

4、自鼻咽慢性炎癥患者活檢標本）及5株細胞系（EBV陰性的鼻咽上皮永生化細胞NP69和鼻咽癌細胞HK-1，EBV陽性的鼻咽癌細胞C666-1、淋巴瘤細胞Raji及狨猴B細胞B95-8）。發(fā)現(xiàn)正常鼻咽上皮組織和EBV陰性的細胞系中，均檢測不到EBV編碼miRNAs及LMP1、EBNA1的表達;而16例鼻咽癌組織及EBV陽性細胞系中，都有BART組40個EBV miRNAs及LMP1、EBNA1的表達，其中14例鼻咽癌組織為高表達;BHRF1組

5、miRNAs則僅在B細胞來源的細胞系Raji及B95-8中有表達，在上皮來源的組織和細胞（不論是正常鼻咽上皮還是鼻咽癌）中均不表達。
　　2、預(yù)測EBV miRNA的宿主靶基因由于BHRF1組的miRNAs在鼻咽癌及對照組織中均不表達，我們只對BART組的EBV miRNAs利用TargetScan和RepTar兩個生物信息學軟件進行了宿主靶基因的預(yù)測;TargetScan預(yù)測發(fā)現(xiàn)BART組EBV miRNAs共有5569個潛在的

6、宿主靶基因，而RepTar預(yù)測了6494個BART組EBV miRNAs潛在的宿主靶基因，其中兩個軟件共同預(yù)測出的潛在宿主靶基因有3140個。EBV BART組40個成熟miRNAs中，BART-18-5p有148個潛在的宿主靶基因，數(shù)目最多，而BART-8、BART-13*和BART-19-3p則沒有預(yù)測到潛在的宿主靶基因。將這3140個潛在的宿主靶基因輸入DAVID軟件中進行功能聚類分析，發(fā)現(xiàn)這些靶基因涉及axon guidance

7、、pathways in cancer、the Wnt signalingpathway、regulation of the actin cytoskeleton及adherens function等信號通路。
　　3、EBV miRNAs潛在宿主靶基因與鼻咽癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的整合分析盡管我們預(yù)測了EBV BART組miRNAs可能調(diào)控3140個宿主靶基因的表達，但生物信息學預(yù)測的結(jié)果需要實驗證據(jù)的進一步支持和驗證。大多數(shù)情況下miR

8、NAs是其靶基因的負調(diào)控因子，由于EBVBART組miRNAs在鼻咽癌中都是表達上調(diào)的，那么它們的宿主靶基因理論上將表達下調(diào)。為此，我們利用SAM軟件重新分析了本實驗室已有的鼻咽癌全基因組表達譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與正常對照組織相比，鼻咽癌中有732個基因的表達顯著失調(diào)，其中上調(diào)基因270個，下調(diào)基因462個。將462個鼻咽癌中顯著下調(diào)的基因與預(yù)測出的3140個EBVmiRNAs潛在宿主靶基因進行比較，最后發(fā)現(xiàn)105個基因在鼻咽癌中顯著下調(diào)，且它

9、們的mRNA也被兩個生物信息學工具TargetScan和RepTar同時預(yù)測到具有EBV miRNAs的結(jié)合位點，因此這105個基因最有可能是EBV miRNAs在鼻咽癌細胞中真正的宿主靶基因。
　　4、繪制EBV miRNA和宿主靶基因間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)我們對這105個在鼻咽癌中表達下調(diào)且具有EBV miRNAs結(jié)合位點的基因進行進一步分析，發(fā)現(xiàn)40個EBV BART miRNAs中有28個miRNAs至少靶向這105個基因中的一個，

10、其中BART-22有37個靶基因、BART-8*有23個、BART-18-5p有12個、BART-9和BART-14各有11個靶基因。類似的，有些基因如ATRX、BTRC、CTBP2、FOXP1和NFIB等在它們mRNA的3'-非翻譯區(qū)有多個EBV miRNAs的結(jié)合位點。在這105個宿主基因和28個EBV BART miRNAs中我們一共找到了175個miRNA:mRNA對，為了充分展示EBV miRNAs和宿主基因mRNA間的調(diào)控關(guān)

11、系，我們利用Pajek軟件繪制了它們間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。
　　5、初步驗證BTRC是EBV miRNA BART-10的靶基因本研究室曾朝陽副研究員等通過全基因組表達譜分析并經(jīng)組織微陣列大樣本驗證了鼻咽癌中WNT信號通路的異常激活與EBV的感染密切相關(guān)，本課題中我們發(fā)現(xiàn)WNT通路中關(guān)鍵分子BTRC是EBV miRNAs的潛在靶基因，且在鼻咽癌中顯著下調(diào)，因此本課題中我們初步驗證了EBV miRNAs對BTRC的調(diào)控。盡管BTRC基因3

12、'-非翻譯區(qū)預(yù)測有多個EBV miRNAs的結(jié)合位點，我們經(jīng)過初步實驗發(fā)現(xiàn)只有EBV miRNA BART-10對BTRC的調(diào)控作用最為明顯。在鼻咽癌和正常對照臨床樣本中，我們發(fā)現(xiàn)EBV miRNA BART-10與BTRC的表達顯著負相關(guān);在鼻咽癌細胞系中轉(zhuǎn)染EBV miRNABART-10的mimics后，通過Real-time PCR和Western blotting我們在mRNA和蛋白水平都驗證了EBV miRNA BART-1

13、0能下調(diào)內(nèi)源性BTRC的表達;最后，采用熒光素酶報告基因?qū)嶒炍覀冏C實了EBVmiRNA BART-10確實可以靶向BTRC mRNA的3'-非翻譯區(qū)直接調(diào)控該基因的表達。以上結(jié)果表明在鼻咽癌中BTRC下調(diào)的原因很可能就是受到EBV miRNA BART-10的調(diào)控，并進一步通過BTRC下游信號通路級聯(lián)反應(yīng)而發(fā)揮生物學效應(yīng)。
　　綜上所述，本課題繪制了一個全面的EBV編碼miRNAs的表達譜，并通過生物信息學預(yù)測結(jié)合鼻咽癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)