鼻咽癌中EB病毒編碼的LMP1調(diào)控mTOR信號(hào)通路及其預(yù)后意義的研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是一種高發(fā)于我國(guó)華南地區(qū)的頭頸部腫瘤，其發(fā)生與環(huán)境、遺傳、EB病毒感染等因素密切相關(guān)。EB病毒是一種人皰疹病毒，鼻咽癌細(xì)胞中潛伏感染的EB病毒能產(chǎn)生一系列基因：EB病毒核抗原1(EBNA1)、潛伏膜蛋白(LMP1，LMP2A，LMP2B)、EB病毒編碼小RNA(EBERs)。其中，潛伏膜蛋白1(LMP1)是一種被公認(rèn)的癌基因，在鼻咽癌中它能

2、通過(guò)激活NF-κB、AP-1及JAK/STAT等信號(hào)通路產(chǎn)生多種病理效應(yīng)(例如促進(jìn)細(xì)胞成長(zhǎng)增殖、促進(jìn)轉(zhuǎn)移、抑制凋亡等)促使腫瘤發(fā)生發(fā)展。因此，探討與LMP1相關(guān)的信號(hào)通路對(duì)于明確鼻咽癌致瘤機(jī)制意義重大。
　　 雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamacin，mTOR)是一種進(jìn)化保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過(guò)調(diào)節(jié)核糖體合成和蛋白翻譯來(lái)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。PI3K/AKT是mTOR信號(hào)通路中重要的上游

3、信號(hào)分子；真核細(xì)胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(eukaryotic initiation factor4E(eIF4E)-binding protein，4E-BP1)和核糖體蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinases，P70S6K)則是該信號(hào)通路兩個(gè)重要的下游靶蛋白。
　　 為了進(jìn)一步明確鼻咽癌中LMP1調(diào)控的信號(hào)通路，本研究擬闡明鼻咽癌中LMP1與mTOR信號(hào)通路之間的關(guān)系，同時(shí)研究LMP1、p-

4、mTOR、p-P70S6K和p-4EBP1在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況，并探討各基因表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系及其預(yù)后意義。
　　 方法：
　　 應(yīng)用人全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)鼻咽癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LMP1細(xì)胞株HONE1-LMP1/HONE1-Vector，篩選與LMP1基因相關(guān)的差異表達(dá)基因。通過(guò)與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，得到差異基因相關(guān)的信號(hào)通路。應(yīng)用定量PCR方法驗(yàn)證芯片結(jié)果。
　　 運(yùn)用Western blot方法檢測(cè)鼻咽

5、癌細(xì)胞株HONE1、6-10B瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染LMP1基因后，mTOR信號(hào)通路各信號(hào)分子的蛋白表達(dá)情況；采用RNA干擾方法沉默鼻咽癌細(xì)胞株C666-1中LMP1基因后，運(yùn)用免疫熒光方法檢測(cè)該細(xì)胞中LMP1及mTOR信號(hào)通路各信號(hào)分子的蛋白表達(dá)情況。
　　 采用免疫組化方法檢測(cè)230例鼻咽癌組織中LMP1、p-mTOR、p-P70S6K和p-4EBP1的表達(dá)情況，并用SPSS16.0軟件分析各基因與臨床病理資料的關(guān)系及其預(yù)后意義

6、。
　　 結(jié)果：
　　 1.基因表達(dá)譜芯片分析得到鼻咽癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株HONE1-LMP1中LMP1調(diào)控的差異表達(dá)基因
　　 將鼻咽癌細(xì)胞系HONE1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染B95.8-LMP1真核表達(dá)質(zhì)粒后進(jìn)行人全基因組芯片分析，共得到1533個(gè)LMP1調(diào)控的差異表達(dá)基因(上調(diào)基因1034個(gè)，下調(diào)基因499個(gè))。通過(guò)與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，把這些差異基因按照通路重新聚類分析，獲得數(shù)條信號(hào)通路。其中，與mTOR信號(hào)通路相關(guān)的差異表

7、達(dá)基因經(jīng)定量PCR驗(yàn)證，其差異表達(dá)情況與芯片結(jié)果完全一致。
　　 2.鼻咽癌細(xì)胞系中LMP1調(diào)控mTOR信號(hào)通路基因
　　 經(jīng)免疫印跡證實(shí)，鼻咽癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株HONE1-LMP1中，LMP1能夠上調(diào)mTOR信號(hào)通路上游分子p-AKT和p-mTOR以及下游信號(hào)分子p-P70S6K和p-4EBP1。同時(shí)，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染LMP1質(zhì)粒的鼻咽癌細(xì)胞系6-10B中，LMP1亦能正向調(diào)控這些信號(hào)分子。
　　 反之，在EBV陽(yáng)性表

8、達(dá)的鼻咽癌細(xì)胞系C666-1中沉默LMP1基因后，經(jīng)免疫熒光顯示，mTOR信號(hào)通路分子p-mTOR和p-4EBP1均表達(dá)下調(diào)。
　　 3.鼻咽癌組織中LMP1及mTOR信號(hào)通路基因的表達(dá)與臨床病理資料的相關(guān)性
　　 在鼻咽癌組織中LMP1的陽(yáng)性表達(dá)部位主要位于腫瘤細(xì)胞胞漿，部分位于胞膜，其陽(yáng)性表達(dá)率為62.9％(141/224)；p-mTOR和p-P70S6K的陽(yáng)性表達(dá)均定位于腫瘤細(xì)胞胞漿，其陽(yáng)性表達(dá)率分別為48.9％(

9、109/223)和47.3％(106/224)；p-4EBP1的陽(yáng)性表達(dá)主要位于腫瘤細(xì)胞胞漿，部分位于胞核，其陽(yáng)性表達(dá)率為57.4％(128/223)。
　　 p-mTOR的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.004)及復(fù)發(fā)(p=0.021)密切相關(guān)；p-P70S6K的高表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(p=0.033)；p-4EBP1高表達(dá)與與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(p=0.045)。而LMP1的表達(dá)與各臨床資料均無(wú)明顯相關(guān)性。經(jīng)過(guò)Spearman

10、's相關(guān)性分析，LMP1高表達(dá)分別與p-mTOR(r=0.359，p＜0.001)、p-P70S6K(r=0.293，p＜0.001)和p-4EBP1(r=0.290，p＜0.001)的高表達(dá)均密切相關(guān)。
　　 4.鼻咽癌組織中LMP1及mTOR信號(hào)通路基因的預(yù)后意義
　　 鼻咽癌組織中，LMP1高表達(dá)組和低表達(dá)組患者5年總生存率分別為54％和68％，兩組間總生存率差異顯著(p=0.020)；p-mTOR高表達(dá)組和低表達(dá)

11、組患者5年總生存率分別為55％和62％，兩組間總生存率無(wú)明顯差異(p=0.311)；p-P70S6K高表達(dá)組和低表達(dá)組患者5年總生存率分別為49％和69％，兩組間總生存率差異顯著(p=0.049)；p-4EBP1高表達(dá)組和低表達(dá)組患者5年總生存率分別為49％和71％，兩組間總生存率差異顯著(p=0.010)。
　　 多因素Cox回歸模型分析結(jié)果顯示LMP1、性別和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移三者是鼻咽癌獨(dú)立的預(yù)后因子。
　　 結(jié)論：